一、 研究作者与发表信息 本研究由 Tom A.W. Schoufour 等人完成，主要作者来自荷兰莱顿大学医学中心的细胞与化学生物学系、皮肤病学系、血液学系、医学肿瘤学系以及功能基因组学系等多个部门。该研究于2024年6月21日发表在学术期刊《iScience》上（卷27，文章编号110120）。
二、 学术背景 本研究属于免疫学和分子生物学交叉领域，聚焦于主要组织相容性复合体 I 类分子。人类白细胞抗原 I 类分子在适应性免疫中至关重要，负责将细胞内的蛋白质片段呈现给细胞毒性 T 细胞的 T 细胞受体，从而在控制感染性疾病和癌症中发挥作用。传统的认识是，HLA-I 类分子的主要相互作用伙伴是 T 细胞受体和自然杀伤细胞受体等免疫细胞受体。尽管已知这些受体与特定的 HLA 等位基因和呈递的肽段存在复杂的特异性识别关系，但由特定 HLA 等位基因与特定肽段组合形成的复合物，其潜在的蛋白质结合表面是否只与这些已知的免疫受体相互作用，尚属未知。换言之，巨大的 HLA-肽段组合多样性可能构成了一个广泛的抗原结合空间，可能存在更多未知的、具有高度特异性的低亲和力相互作用。因此，本研究旨在系统性地探索是否存在其他类型的表面分子能够以等位基因和肽段特异性的方式与 HLA-I 类分子结合，并揭示这类相互作用的特性。
三、 详细研究流程 本研究采用了系统性的功能基因组学筛选与精细的生物化学验证相结合的策略，其工作流程可分为以下几个关键步骤：
1. 基于 CRISPR-Cas9 激活筛选的首次发现 研究团队首先设计了一种创新的“受体-配体”筛选策略，以重组 HLA-I 类分子四聚体作为“诱饵”。他们构建了一个稳定表达 dCas9 的 K562 细胞系，并用一个覆盖全基因组的 CRISPR-Cas9 激活文库（Calabrese library）进行转导，从而获得一个每个细胞都过表达不同基因（包括细胞表面蛋白）的细胞池。随后，他们使用三种不同 HLA 等位基因（HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-C*07:01）与高亲和力肽段（分别来自巨细胞病毒和肿瘤抗原）形成的四聚体混合池对这个细胞库进行染色。通过流式细胞分选技术，分离出与四聚体结合呈阳性的细胞，并利用下一代测序分析这些细胞中富集的向导 RNA。此筛选成功复现了已知的 HLA-I 相互作用分子 LILRB1 和 LILRB2，验证了筛选系统的可靠性。同时，筛选结果显示 CD55（一种糖基磷脂酰肌醇锚定的表面蛋白）的向导 RNA 被显著富集，提示 CD55 可能是 HLA 四聚体的一个新结合伙伴。
2. CD55 与 HLA-C*07:01-vrig 相互作用的验证与表征 在获得初步线索后，研究进入验证与机制探索阶段。首先，他们构建了过表达 CD55 的 K562 细胞，并使用单一的四聚体进行染色，确认了结合特异性：CD55 仅与负载了 VRIGHVYIL（vrig）肽段的 HLA-C*07:01 四聚体结合，而不与其他 HLA 等位基因的四聚体结合。随后，通过体外共免疫沉淀实验，直接证明了 CD55-Fc 融合蛋白能够与 HLA-C*07:01-vrig 四聚体结合，而不能与其他四聚体结合，证实了相互作用的直接性。利用多种内源性高表达 CD55 的癌细胞系（如 HeLa、PC-3M、Siha）以及 CD55 基因敲除的 HeLa 细胞，进一步在生理相关背景下验证了该相互作用的特异性和 CD55 依赖性。通过构建 CD55 截短突变体（逐步删除其四个 sushi 结构域）并使用针对不同结构域的单克隆抗体进行阻断实验，他们将 HLA-C*07:01-vrig 的结合位点精确定位在 CD55 的 SCR2 和 SCR3 结构域的交界区域。为了探究 HLA 分子的决定性因素，研究测试了仅有一个氨基酸差异的 HLA-C*07:02 等位基因，发现其与 vrig 肽段形成的四聚体完全丧失了与 HeLa 细胞的结合能力，表明了高度的等位基因特异性。此外，他们对 vrig 肽段进行了系统的丙氨酸扫描突变，发现除了两个必需的锚定残基外，肽段中五个暴露的氨基酸残基对结合至关重要。最后，利用表面等离子共振技术测定了 CD55-Fc 与 HLA-C*07:01-vrig 四聚体相互作用的亲和力，解离常数约为 1.4 µM，属于典型的低亲和力相互作用，这与 TCR-pMHC 相互作用的亲和力范围相似，而单体形式的 HLA-C*07:01-vrig 在最高浓度下也未能检测到结合，解释了为何需要使用四聚体（通过增加亲合力）来检测此类相互作用。
3. 扩展筛选与第二个相互作用对的发现 基于第一个发现提出的“HLA-肽段复合物可能构成独特的蛋白结合表面”这一概念，研究团队试图寻找更多此类相互作用。他们筛选了 116 种不同的重组 HLA-I 类四聚体（涵盖 HLA-A、-B、-C 的不同等位基因与多种肽段组合），以检测它们与 HeLa 细胞的结合。结果发现，负载 YRFRFRSVY（yrfr）肽段的 HLA-C*07:02 四聚体能够染色 HeLa 细胞，而其他 115 种四聚体均不能。为了鉴定其结合伙伴，他们针对这一特定四聚体进行了另一轮全基因组筛选，但采用了两种互补的策略。首先，在 MelJuSo 细胞中进行了 CRISPR-Cas9 敲除筛选：用 HLA-C*07:02-yrfr 四聚体染色，分选出不结合的阴性细胞，分析其中富集的向导 RNA。该筛选显著富集了多个与硫酸乙酰肝素生物合成通路相关的基因，如 EXT1、EXT2、UGDH 和 GOLPH3。其次，在 K562 细胞中进行了 CRISPR-Cas9 激活筛选：分选出与 HLA-C*07:02-yrfr 四聚体结合增强的阳性细胞。此筛选除了富集 LILRB1/LILRB2，还鉴定出了 Syndecan-1、-2、-4（SDC1/2/4），这是一类细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
4. HLA-C*07:02-yrfr 与硫酸乙酰肝素链相互作用的验证与表征 两个筛选结果共同指向了细胞表面的硫酸乙酰肝素链。验证实验证实：过表达 SDC1、2、4 能增强 K562 细胞表面的硫酸乙酰肝素水平和 HLA-C*07:02-yrfr 结合；敲除硫酸乙酰肝素合成通路基因（EXT1、EXT2、UGDH）或使用肝素酶 II 去除细胞表面的硫酸乙酰肝素链，能显著降低或完全消除 MelJuSo 细胞与四聚体的结合；而用游离的硫酸乙酰肝素链预先孵育四聚体，则可以竞争性地抑制其与细胞的结合，证明相互作用是直接的。与 CD55 的案例类似，该相互作用也表现出严格的等位基因特异性：HLA-C*07:01 搭载 yrfr 肽段的四聚体无法结合。对 yrfr 肽段的丙氨酸扫描显示，肽段中的精氨酸残基对结合至关重要，这与带负电的硫酸乙酰肝素链倾向于与带正电的氨基酸相互作用的特性相符。
5. 数据整合与模型构建 研究团队利用结构建模工具，将 HLA-C*07:01-vrig 和 HLA-C*07:02-yrfr 复合物中对于结合各自配体至关重要的氨基酸残基映射到分子表面。计算显示，这两个复合物用于结合的潜在表面积相对较小（分别为 249 Ų 和 275 Ų），远小于典型抗体的抗原结合表面积（例如，单域骆驼抗体 CAB-05 约为 620 Ų）。这种较小的接触面积可以部分解释其较低的亲和力，并再次强调了其与 TCR-pMHC 相互作用的相似性。
四、 主要研究结果 1. 发现了全新的 HLA-I 类分子相互作用类型：通过全基因组 CRISPR-Cas9 激活筛选，首次鉴定出 CD55 作为 HLA-C*07:01-vrig 四聚体的特异性结合伙伴。这打破了 HLA-I 类分子仅与 TCR、KIR、LILR 等免疫受体相互作用的传统认知。 2. 揭示了相互作用的精确特异性：对 CD55 的相互作用表征表明，其具有双重特异性：第一，严格的等位基因特异性，HLA-C*07:01 与 C*07:02 之间单个氨基酸的差异足以完全消除结合；第二，高度的肽段特异性，呈递肽段中多个暴露的氨基酸残基对结合至关重要。其亲和力在微摩尔级别，属于低亲和力、高特异性相互作用。 3. 建立了系统性的发现平台：研究证明了利用 CRISPR 筛选结合重组 HLA 四聚体作为诱饵，是发现未知的 pMHC 相互作用蛋白的有效策略。 4. 发现了第二个独立的相互作用对：通过扩展筛选，发现了第二个具有类似特性的相互作用对：HLA-C*07:02-yrfr 四聚体特异性结合细胞表面的硫酸乙酰肝素链。该相互作用的发现同样依赖于 CRISPR 敲除和激活筛选，并同样具有严格的等位基因和肽段特异性。 5. 提出了“HLA-肽段复合物作为可变蛋白结合表面”的新概念：两个独立的案例强有力地支持了作者的假设：由不同 HLA 等位基因和肽段组合形成的复合物，可以像抗体的互补决定区一样，构成多样化的蛋白质结合表面，能够以高特异性、低亲和力的方式识别不同的配体。 6. 量化了相互作用特征：通过 SPR 测定了亲和力，通过结构建模估算了结合表面积，将这些新发现的相互作用在物理化学参数上与经典的 TCR-pMHC 相互作用进行了类比，为其“类 TCR”特性提供了定量依据。
五、 结论与意义 本研究得出结论：HLA-I 类肽段复合物能够超越传统的免疫受体，与 CD55 和硫酸乙酰肝素链等其他类型的表面分子发生相互作用。这些相互作用在等位基因特异性、肽段特异性和低亲和力特性上，与经典的 TCR 识别 MHC 复合物的模式高度相似。这表明，由于 HLA 系统的多态性和肽段的多样性，pMHC 复合物可能参与更多目前未知的、高度特异性的细胞间或分子间识别事件。
该研究的科学价值在于： 1. 拓展了对 HLA-I 类分子生物学功能的理解：将 HLA-I 类分子的潜在作用从免疫监视扩展到了更广泛的细胞识别和信号传导领域。 2. 提供了一种强大的研究方法学：建立的 CRISPR 筛选与 pMHC 四聚体结合的技术平台，为系统性地挖掘 pMHC“相互作用组”提供了蓝图。 3. 揭示了潜在的背景干扰源：为以往使用 HLA 四聚体检测抗原特异性 T 细胞时观察到的无法解释的“背景染色”提供了可能的分子机制，提示某些四聚体可能非特异性地结合了类似 CD55 或硫酸乙酰肝素的分子。 4. 开辟了新的应用前景：研究提出，这类具有高特异性、低亲和力的 pMHC 复合物，特别是其肽段可以通过化学修饰进行改造，有可能被开发成一种新型的生物工具或治疗剂，例如用于激动或拮抗特定的细胞表面受体，类似于抗体药物，但具有独特的理化性质和调控潜力。
六、 研究亮点 1. 重要发现：首次报道了 HLA-I 类分子能以精确的等位基因和肽段依赖性方式，与 CD55 和硫酸乙酰肝素这两类非免疫受体分子结合。 2. 方法创新：创造性地将全基因组 CRISPR-Cas9 功能获得/缺失筛选与重组 HLA 四聚体染色技术相结合，建立了一个高效、无偏倚地发现 pMHC 新配体的强大平台。 3. 概念新颖：提出了“pMHC 复合物构成多样化蛋白结合表面”这一新范式，挑战了对其功能的传统认知，并暗示可能存在一个庞大的、未被探索的 pMHC 相互作用网络。 4. 研究的系统性：从最初的筛选、到单个案例的深入表征、再到扩展发现第二个案例并进行平行验证，整个研究逻辑严密，证据链条完整，结论坚实。
七、 其他有价值的内容 研究在讨论部分也坦诚地指出了本工作的局限性：首先，所有相互作用都是使用重组、四聚体化的 HLA 蛋白鉴定的，尚不清楚这些相互作用在生理条件下、由细胞表面自然表达的 HLA-I 类分子所介导时是否会发生及其功能意义。其次，pMHC 组合的数量极其庞大，系统性地发现所有潜在相互作用面临巨大挑战。这些局限性为未来的研究指明了方向，例如在生理环境下验证这些相互作用的功能，以及利用酵母展示文库等技术进一步探索 pMHC 的结合空间。