结直肠癌免疫检查点阻断反应的免疫基因组学：KEYNOTE 177试验及验证队列分析

一、 研究团队与发表信息

本研究的主要作者包括 Michele Bortolomeazzi、Mohamed Reda Keddar、Lucia Montorsi 等，通讯作者为 Francesca D. Ciccarelli 和 Jo Spencer。研究团队主要来自英国弗朗西斯·克里克研究所（The Francis Crick Institute）和伦敦国王学院（King’s College London），并联合了多家英国医疗与研究机构的合作者。该研究于2021年发表在胃肠病学领域的顶级期刊 *Gastroenterology*（第161卷，第1179-1193页）。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于肿瘤免疫治疗与精准医学交叉领域。尽管免疫检查点抑制剂（如抗PD-1药物帕博利珠单抗[Pembrolizumab]和纳武利尤单抗[Nivolumab]）已成功应用于多种癌症，但在结直肠癌（CRC）中，其疗效存在显著差异。已知高肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）与错配修复缺陷/高度微卫星不稳定（dMMR/MSI-H）型CRC（即高突变型CRC）对免疫治疗的部分反应相关，但仍有约一半的高突变型CRC患者无法从治疗中长期获益。这表明TMB作为预测标志物存在局限性，决定CRC对免疫检查点阻断反应的更深层分子与细胞机制尚不清楚。

因此，本研究旨在超越TMB，通过整合多维度的组学与空间分析技术，系统剖析CRC对PD-1抑制剂反应的细胞与分子决定因素。具体目标是：1）明确TMB在CRC免疫治疗预测中的确切作用边界；2）在高突变型CRC中，识别区分有持久获益（Durable Benefit, DB）与无持久获益（No Durable Benefit, NDB）患者的关键特征；3）深入解析肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中，特别是免疫细胞亚群的空间相互作用如何影响治疗结局。

三、 详细研究流程与方法

本研究采用了多层次、多组学、多区域的综合性分析策略，分为发现队列和验证队列。

1. 研究队列与样本处理： * 研究对象： 共纳入29名接受抗PD-1免疫治疗（帕博利珠单抗或纳武利尤单抗，一线或后线）的晚期结直肠癌患者。其中16名患者构成发现队列，13名患者构成独立验证队列。患者根据实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.1）被分为持久获益组（DB-CRC，疾病无进展生存期≥12个月）和无持久获益组（NDB-CRC，疾病在12个月内进展）。 * 样本来源： 研究使用患者治疗前的原发性或局部复发性肿瘤手术切除标本制成的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。 * 多区域采样策略： 为了克服肿瘤内异质性，研究者从每个肿瘤块中选取了多个具有不同T细胞浸润程度的区域进行分析。总共分析了来自29名患者的738个肿瘤区域。这种多区域取样对于准确评估肿瘤的克隆结构和免疫微环境异质性至关重要。

2. 实验技术与分析流程： 研究对选取的肿瘤区域并行进行了以下一系列高通量实验和计算分析：

• 免疫组织化学（IHC）与组织学分析： 首先，在多个连续切片上进行CD3免疫组化染色，以量化每个区域的T细胞密度（细胞数/mm²），并确认肿瘤内T细胞浸润的异质性。这为后续选择具有不同免疫背景的区域进行深度分析奠定了基础。
• 全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）： 对发现队列中每个患者选取的高、低T细胞浸润区域（共32个区域）及其匹配的正常组织进行WES。分析内容包括：
  • 肿瘤突变负荷（TMB）计算： 评估每个区域的非同义突变总数。
  • 克隆性分析： 使用PyClone等工具推断肿瘤内亚克隆结构，评估免疫原性突变（预测能产生新抗原的突变）的克隆性（即存在于大部分肿瘤细胞中还是仅存在于亚克隆中）。
  • 拷贝数变异与基因损伤分析： 识别关键信号通路（如Wnt通路）中的基因改变。
• RNA测序（RNA-Seq）： 对来自两个队列的88个显微切割区域进行RNA-Seq。用于：
  • 差异基因表达分析： 比较不同组别（如高突变 vs. 非高突变，DB vs. NDB）的转录组特征。
  • 通路富集分析： 使用MetaCore等工具识别被激活或抑制的生物学通路（如Wnt信号、干扰素-γ通路）。
• 成像质谱流式技术（Imaging Mass Cytometry, IMC）与多重免疫荧光（Multiplexed Immunofluorescence, MIF）： 这是本研究的核心技术亮点，用于在单细胞水平上对组织切片进行高维（高达42个标记物）表型分析和空间定位。
  • IMC： 在77个区域上使用包含T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、中性粒细胞以及肿瘤和基质结构标记物的抗体面板。通过金属同位素标记抗体，利用质谱成像对组织切片进行扫描，获得所有标记物在组织原位的高维表达数据。
  • 数据分析： 使用研究团队开发的软件SIMPLI (Single-cell Identification from Multiplexed Images) 进行图像预处理、像素分析、细胞分割和细胞类型鉴定。随后利用Seurat进行无监督单细胞聚类，以识别新的细胞亚群。此外，使用DBSCAN算法识别高密度细胞簇。
  • MIF： 在24张完整切片上使用8色免疫荧光，以更高分辨率验证关键细胞相互作用（如PD-1/PD-L1共定位）。
• T细胞受体β链测序（TCR-Seq）： 对发现队列的28个区域进行TCR测序，以评估T细胞克隆的多样性（克隆性）和扩增情况。
• PD-1/PD-L1原位相互作用检测（Amplified Förster Resonance Energy Transfer, a-FRET）： 在58个区域使用a-FRET技术原位定量检测PD-1与PD-L1蛋白之间的相互作用（形成复合物）强度，这比单纯检测mRNA或蛋白表达更能反映功能性免疫检查点状态。
• 整合性数据分析： 将上述所有数据（基因组、转录组、蛋白空间组、T细胞受体组）进行整合关联分析，以构建一个全面的、多尺度的肿瘤-免疫微环境图谱。

四、 主要研究结果

1. TMB的预测价值存在明确上限，克隆性免疫原性突变和T细胞是关键。 * 结果：研究发现，在CRC中，TMB与肿瘤内T细胞浸润密度无关。更重要的是，在高突变型CRC内部（TMB > 12 mut/Mb），DB-CRC和NDB-CRC之间的TMB没有显著差异。这表明，TMB是区分高突变型（可能获益）与非高突变型（基本不获益）CRC的必要条件，但不足以预测高突变型CRC内部的治疗反应。 * 深入分析：研究者发现，DB-CRC与NDB-CRC在免疫原性突变的总比例（新抗原指数）上无差异，但DB-CRC拥有显著更多的克隆性免疫原性突变（即这些突变存在于绝大多数肿瘤细胞中）。同时，TCR测序显示DB-CRC的T细胞受体库克隆性更高，表明存在针对这些广泛存在的肿瘤新抗原的、扩增的T细胞克隆。这提示，免疫原性靶点的“质量”（克隆性、广泛存在性）比单纯的数量（TMB）更为重要。

2. 应答与非应答的高突变型CRC在肿瘤细胞内在特性上存在差异。 * Wnt信号通路： 与非高突变型CRC相比，高突变型CRC的Wnt通路下游靶基因转录水平显著降低。已知Wnt信号激活会抑制T细胞浸润，这解释了为何高突变型CRC整体上更具“免疫热肿瘤”特征（富含细胞毒性CD8+ T细胞）。然而，在DB-CRC中，Wnt通路的激活程度比NDB-CRC更低，可能为更有效的免疫攻击创造了更有利的条件。 * 抗原提呈机制缺陷： 转录组分析显示，DB-CRC中干扰素-γ通路和抗原提呈相关基因广泛失调。引人注目的是，两名DB-CRC患者携带B2M（β2-微球蛋白）基因的克隆性截短突变，导致肿瘤细胞完全丧失MHC I类分子表达。IMC蛋白水平检测证实，与B2M野生型肿瘤相比，这些突变肿瘤的B2M蛋白表达缺失。更广泛地，DB-CRC肿瘤区域的B2M蛋白表达水平显著低于NDB-CRC（尽管并非完全缺失）。这与黑色素瘤中B2M缺失导致耐药的传统认知相反，提示CRC中可能存在独特的免疫逃逸与应答机制。

3. 肿瘤微环境的空间组成决定治疗结局：CD74+抗原提呈巨噬细胞是核心角色。 * T细胞亚群： 单细胞水平的深度分析（IMC）显示，高突变型CRC普遍富含颗粒酶B阳性（GZB+）的细胞毒性CD8+ T细胞和Ki67+的增殖性CD8+ T细胞。然而，DB-CRC与NDB-CRC在总体T细胞浸润或任何特定的T细胞亚群比例上均无显著差异。这表明，尽管细胞毒性T细胞的存在是必要的，但其本身并不足以保证治疗成功。 * 巨噬细胞亚群的发现： 通过无监督聚类，研究团队发现了一个独特的CD68+CD74+巨噬细胞亚群。该亚群在DB-CRC中的比例显著高于NDB-CRC，这一发现在发现队列和验证队列中均得到证实。 * CD74+巨噬细胞的表型与功能： 进一步表征显示，这些CD74+巨噬细胞高表达抗原提呈相关分子（HLA-ABC, HLA-DR, CD40）以及M1型（CD16, CD163）和部分M2型（CD206, FolR2）标记，表现出混合/可塑的表型。重要的是，其中约40%的细胞同时表达PD-L1。 * 关键的细胞间相互作用： 空间分析揭示了决定性的模式：在DB-CRC中，CD68+CD74+PD-L1+巨噬细胞与PD-1+的细胞毒性（GZB+）和增殖性（Ki67+）CD8+ T细胞在空间上紧密相邻。计算细胞间距离和MIF高分辨率成像均证实了这种物理上的近距离接触和PD-1/PD-L1共定位。这些细胞甚至倾向于形成高密度簇，类似于一个功能性的免疫微环境单元。 * PD-1/PD-L1表达模式： 与许多其他癌种不同，CRC中PD-1和PD-L1的基因和蛋白表达水平普遍较低，且其表达量与治疗反应无关。a-FRET检测到的功能性PD-1/PD-L1相互作用也较少。这暗示在CRC中，PD-1/PD-L1检查点的功能可能更集中于这些特定的细胞间相互作用位点，而非广泛表达。

五、 研究结论与意义

本研究得出了几个核心结论： 1. 重新定义TMB的预测角色： 在结直肠癌中，高TMB（>12 mut/Mb）是免疫治疗应答的“入场券”，但超过此阈值后，其预测价值有限。应答更依赖于克隆性免疫原性突变和相应的克隆性扩增的T细胞。 2. 揭示应答的肿瘤内在特征： 应答的高突变型CRC具有更低的Wnt通路活性和更频繁的抗原提呈机制（如B2M）失调，这可能是免疫编辑和逃逸的结果，但也可能塑造了一个特定的、对免疫治疗敏感的微环境。 3. 发现关键的免疫微环境决定因素： 本研究最重要的发现是，CD74+抗原提呈巨噬细胞是区分应答者与非应答者的最一致的免疫特征。这些巨噬细胞通过PD-L1与肿瘤内活化的PD-1+ CD8+ T细胞相互作用。 4. 提出作用机制模型： 研究者提出，在应答的高突变型CRC中，抗PD-1药物的作用机制可能是解除CD74+PD-L1+巨噬细胞对邻近细胞毒性/增殖性PD-1+ CD8+ T细胞的抑制，从而重新激活其抗肿瘤活性。这种特定的细胞间相互作用，而非整体的PD-1/PD-L1表达水平，可能是治疗的关键靶点。

科学价值与应用价值： * 科学价值： 本研究通过创新的多组学空间分析，为理解CRC免疫治疗的复杂反应机制提供了前所未有的深度和细节。它强调了超越TMB、结合肿瘤克隆性、通路活性和特异性免疫细胞空间构象进行综合评估的重要性。研究还揭示了CRC与其他癌种（如黑色素瘤、肺癌）在免疫治疗生物标志物（如B2M缺失、PD-L1表达）上的差异，提示需要制定癌症类型特异性的预测模型。 * 应用价值： 研究结果为改善CRC免疫治疗的患者分层提供了新的潜在生物标志物组合：克隆性免疫原性突变 + CD74+巨噬细胞浸润。这有望在未来通过临床可用的检测方法（如多重免疫组化）进行验证和应用，从而更精准地筛选出最可能从抗PD-1治疗中获益的患者。同时，CD74+巨噬细胞本身也可能成为新的治疗靶点。

六、 研究亮点

1. 创新性的多模态整合分析： 将多区域基因组学、转录组学、高维空间蛋白组学（IMC/MIF）、T细胞受体组学和原位蛋白质相互作用检测（a-FRET）无缝整合，构建了CRC免疫微环境的全景式图谱。
2. 克服肿瘤异质性的研究设计： 采用多区域取样策略，有效揭示了肿瘤内部在遗传和免疫景观上的异质性，使结论更加可靠。
3. 关键细胞亚群的发现与空间验证： 首次通过高维技术鉴定出CD74+巨噬细胞是CRC抗PD-1治疗应答的关键相关因素，并利用空间分析技术原位证实了其与效应CD8+ T细胞的功能性相互作用，将细胞组成与空间关系联系起来，超越了传统的bulk分析。
4. 对经典生物标志物的重新审视： 明确界定了TMB在CRC中的预测局限性，并挑战了关于B2M缺失和PD-L1表达作为通用耐药/预测标志物的传统观点，推动了领域内更精细化的思考。
5. 开发并应用新型分析工具： 使用了团队自研的成像数据分析软件SIMPLI，展示了先进计算方法在解析复杂生物图像数据中的强大能力。

七、 其他有价值的内容

研究还讨论了其局限性，主要是由于抗PD-1疗法在高突变型CRC中的使用限制，导致患者队列规模有限。研究者呼吁需要来自前瞻性研究的数据进行进一步验证。此外，研究数据（WES、RNA-Seq、TCR-Seq、IMC）已公开存入欧洲基因组-表型组档案库（EGA）和Zenodo，促进了研究的可重复性和数据的二次利用价值。