本研究由清华大学、中国人民解放军总医院第一医学中心以及北京科学技术研究院新材料与先进制造研究所的徐新新、高云鹤、代建利等作者共同完成，研究成果以题为“Gastric cancer assembloids derived from patient-derived xenografts: a preclinical model for therapeutic drug screening”的学术论文发表于《Small Methods》期刊。
胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管诊断和治疗手段不断进步，但胃癌的高发病率和死亡率仍然严峻，亟需开发新的治疗方法。精准医疗背景下，高通量药物筛选已成为寻找有效治疗靶点的重要手段，但其成功高度依赖于能够准确模拟人体内肿瘤复杂特征的临床前模型。目前，现有的体外肿瘤模型，如传统的二维细胞培养、患者来源异种移植瘤模型以及患者来源类器官模型，各自存在显著的局限性。二维培养缺乏三维结构，生理病理状态发生改变，无法反映真实的药物反应。PDX模型虽然更接近人体内环境，但其建立和维护耗时耗力、成本高昂，不适合大规模筛选；且在传代过程中，人源的肿瘤微环境成分（如基质细胞）会被小鼠来源的成分替代，影响了肿瘤生长和治疗反应的真实性。PDO/PdxO等三维类器官模型能更好地模拟肿瘤的物理特性，但存在批次间变异大、生长不可控、缺乏患者来源的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）等挑战，影响了其在药物疗效临床前评估中的可重复性和准确性。肿瘤微环境是一个包含肿瘤细胞、癌症相关成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质等多组分的高度复杂系统，其中CAFs对肿瘤的增殖、侵袭和药物反应具有关键影响。因此，构建一种能够稳定、高通量地复现胃癌肿瘤微环境，并能准确预测临床药物反应的体外模型，是胃癌研究和精准治疗领域的迫切需求。本研究旨在利用微滴微流控技术，结合患者来源异种移植瘤细胞和患者基质细胞，开发一种新型的胃癌“组装体”模型，以克服现有模型的缺陷，为高效、精准的药物筛选提供可靠的平台。
本研究的工作流程包含多个关键步骤，涉及模型构建、材料优化、模型表征验证以及药物筛选应用。首先，研究团队从胃癌患者手术样本或已建立的PDX组织中分离原代细胞。通过胶原酶消化和过滤，将组织解离为单细胞悬液。一部分细胞在基质胶中培养，形成患者来源类器官或PDX来源类器官，用于扩增肿瘤细胞；另一部分细胞在含血清的培养基中贴壁培养，从中分离和扩增人源癌症相关成纤维细胞。这是构建包含异质细胞成分模型的基础。接下来，研究团队致力于开发用于封装细胞、形成组装体的理想水凝胶材料。他们比较了四种不同的水凝胶复合物：仅 GelMA、GelMA+明胶、GelMA+基质胶，以及最终选定的 GelMA-明胶-基质胶复合水凝胶。GelMA具有良好的生物相容性和便捷的光交联特性；基质胶能为类器官生长提供有利环境；而明胶作为“牺牲性”材料，其加入提高了水凝胶的粘度，有效防止了细胞在组装过程中的沉淀和聚集，从而保证了细胞分布的均匀性。当水凝胶在37℃孵育时，明胶溶解，增大了材料的孔隙率。扫描电镜分析和力学性能测试表明，GGM水凝胶具有与真实胃癌组织相似的孔隙结构和杨氏模量，且能维持较高的细胞活力和增殖率。材料优化是本模型成功的关键前提。
模型构建的核心是采用基于T型结芯片的微滴微流控平台。研究团队将PDOs/PdxOs和其对应的HCAFs以特定比例混合于配置好的GGM水凝胶“生物墨水”中。该水相生物墨水与含有表面活性剂的矿物油在微流控芯片的T型结处相遇，在精确的流速比下，油相将水相剪切形成均匀的单分散微滴。收集这些包裹细胞的微滴后，先进行低温物理交联，再用405 nm波长的紫外光进行光交联固化，最终形成大小均一的胃癌组装体。微滴微流控技术实现了组装体的大规模、可控、均一化制备，而GGM水凝胶的特性则确保了制备过程中细胞的活性和均匀分布。由此构建的模型分为两类：直接使用患者原代肿瘤细胞构建的患者来源组装体，以及使用PDX扩增后的肿瘤细胞构建的PDX来源组装体。后续分析表明，PDA和PDXA在细胞活力、最终形态和均一性上无显著差异，但PDXA在产量上具有显著优势，从相同体积的亲代肿瘤组织中可获得比PDA多六倍的组装体，极大提升了药物筛选的通量。
在模型表征与验证方面，研究团队从组织学、转录组学和功能学三个层面进行了全面评估。组织学上，通过苏木精-伊红染色、免疫荧光和免疫组化分析，发现PDA和PDXA均能复现其亲代肿瘤的组织学特征，包括异质性细胞群（Epcam阳性的肿瘤细胞和α-SMA阳性的HCAFs）的分布模式、细胞分化程度、紊乱的组织结构以及Ki-67增殖标志物的表达水平。这表明组装体成功模拟了原发肿瘤的细胞组成和空间结构。转录组学层面，对来自五名患者的肿瘤样本、配对正常组织、PDA和PDXA进行了批量RNA测序。结果显示，无论是PDA还是PDXA，其全转录组表达谱与对应亲代肿瘤均具有高度相似性，皮尔逊相关系数均高于0.80，且与PDX模型相当。差异表达基因分析、通路富集分析以及标志基因表达分析进一步证实，组装体与亲代肿瘤在细胞周期、DNA复制、细胞外基质相关基因、CAF相关基因、癌症细胞相关基因以及癌症干细胞相关基因的表达谱上高度一致，表明组装体在分子水平上保留了亲代肿瘤的关键特征。
为了验证组装体模型预测临床药物反应的能力，研究团队开展了功能性药物筛选实验。他们选取了已知对特定化疗方案敏感或耐药的患者样本构建模型。例如，对XELOX或SOX方案耐药的两位患者，其临床CT影像显示肿瘤进展。利用这些患者的样本构建的PDA、PDX和PDXA模型，在体外药物敏感性测试中，均一致显示对奥沙利铂、5-FU（卡培他滨和TS-1的体内活性成分）及其联合用药方案耐药，而对紫杉醇敏感。同时，在对应的PDX小鼠体内药效学实验中，也观察到了完全一致的结果：PDX肿瘤对联合化疗耐药（肿瘤体积和重量显著增加），而对紫杉醇治疗敏感。同样，对于临床化疗敏感的患者样本，其对应的组装体模型在体外也表现出了相应的药物敏感性。这些结果强有力地证明，组装体模型的药物反应能够高度一致地反映患者的临床结局以及PDX模型的体内药效，具备了作为临床前预测工具的潜力。
在证明了模型预测准确性的基础上，研究进一步展示了PDXA模型在高通量药物筛选中的应用价值。研究团队构建了来自6个PDX样本的PDXA活体库，并对每个样本进行了包含12种临床常用化疗药和靶向药的大规模药物测试。实验将10个均一的PDXA置于96孔板每孔中进行处理，通过CellTiter-Glo 3D检测细胞活力。结果显示，不同患者来源的PDXA对不同药物表现出显著的异质性反应，这与临床观察到的患者间疗效差异相符。更重要的是，平行孔间的细胞活力变异系数极低，99%的情况下低于0.2，显示出卓越的筛选结果一致性和可重复性，完全满足高通量筛选对稳定性和可靠性的严格要求。
本研究的结论是，成功建立了一种基于微滴微流控技术和GGM复合水凝胶的、新型的胃癌患者来源异种移植瘤组装体模型。该策略有效解决了组装过程中细胞聚集和沉降的问题，实现了大规模细胞负载水凝胶的操控和高通量均一化组装体的生产。PDXA模型不仅在转录组和组织学水平上与亲代原发肿瘤高度一致，而且易于规模化扩增，适用于临床前药物筛选。尤为关键的是，该体外组装体模型的药物筛选结果能够准确地反映对应患者的临床药物反应以及PDX模型的体内药效。因此，本研究开发的胃癌组装体，作为一种能有效复现体内肿瘤微环境的模型，为更精准的高通量药物筛选和预测个体化治疗结局提供了极具潜力的平台。
本研究的亮点和创新之处在于：第一，方法学创新：首次将微滴微流控技术与特制的GGM复合水凝胶相结合，用于构建胃癌组装体，实现了模型的高通量、高均一性、可控化制备，克服了传统类器官生长不均和手工共培养不可控的缺点。第二，模型优势显著：所构建的PDXA模型巧妙结合了PDX模型（可大规模扩增患者肿瘤细胞）和共培养组装体模型（可保留患者特异性基质微环境）的双重优势，在保持肿瘤分子和组织学特征真实性的同时，大幅提升了可用于药物筛选的样本通量。第三，验证体系全面：研究从材料特性、组织形态、基因表达、药物反应（体外与体内对照、与临床结局对照）等多个维度，系统且严谨地验证了模型的可靠性和预测准确性，证据链完整。第四，应用前景明确：研究不仅证明了模型对已知临床结局的回顾性预测能力，还通过大规模药物库筛选展示了其在发现新药、评估联合疗法及实现个性化医疗方面的直接应用价值。本研究为胃癌乃至其他实体瘤的转化研究和药物开发提供了一种强有力的新型工具。