TGM2催化的IκBα共价交联驱动NF-κB核转位以促进衰老小胶质细胞中的SASP

主要作者与发表信息

本研究由清华大学生命科学学院、合成与系统生物学中心及生物信息学教育部重点实验室的李志强、王天翔、杜思静等人共同完成，通讯作者为中国中医科学院望京医院的魏玮和清华大学的邓海腾。该研究发表于 Aging Cell 期刊，2025年第24卷，文章编号e14463，于2024年7月30日投稿，2024年11月22日接收。

学术背景

小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的常驻免疫细胞，约占脑细胞总数的12%，在维持脑内稳态和清除代谢废物方面发挥关键作用。在衰老过程中，小胶质细胞会进入细胞衰老（cellular senescence）状态，其吞噬能力下降，同时通过衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）加剧神经炎症。这一过程与阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease, AD）等多种神经退行性疾病的发生发展密切相关。SASP因子可改变细胞微环境并与免疫系统协同作用，加速邻近细胞的衰老，因此衰老小胶质细胞已成为神经退行性疾病治疗的潜在靶点。

转谷氨酰胺酶2（transglutaminase 2, TGM2）是一种钙离子依赖的双功能酶，同时具有转谷氨酰胺酶活性和GTP酶活性。TGM2的表达和活性受NF-κB和IL-6的调控，而小胶质细胞是脑内TGM2的主要来源。已有研究表明，在小胶质细胞中敲除TGM2会导致突触重塑受损和认知功能下降，说明TGM2对正常神经发育至关重要。然而，TGM2在衰老小胶质细胞中的具体作用及其分子机制尚不明确。NF-κB通路在衰老过程中活性增加，导致慢性炎症，其异常激活与肥胖和神经退行性疾病等年龄相关疾病密切相关。NF-κB的激活会进一步上调TGM2表达并促进IL-1α、IL-6等SASP因子的产生，提示TGM2与NF-κB之间可能存在正反馈调节环路。本研究旨在阐明TGM2在衰老小胶质细胞中的功能和作用机制，并评估TGM2抑制剂作为抗衰老药物或衰老形态调节剂（senomorphics）的潜力。

研究流程

本研究包含细胞实验、分子机制解析和动物实验三个主要层面。

在细胞实验层面，研究者首先建立了衰老小胶质细胞模型。体内实验采用22月龄的C57BL/6J小鼠（n=3），通过单细胞悬液制备仪处理脑组织后，利用CD11b+细胞分选试剂盒分离原代小胶质细胞，经流式细胞术分选纯化后继续培养3周，以Spider-βGal实验鉴定衰老细胞。体外实验则使用BV2小胶质细胞系，以10 μM依托泊苷（etoposide）诱导DNA损伤型衰老。为验证TGM2在衰老小胶质细胞中的高表达，研究者采用了免疫组化（immunohistochemistry, IHC）染色检测年轻（4月龄）和老年（22月龄）小鼠海马CA1和CA3区域的TGM2蛋白表达，并通过Western blot（WB）对海马组织和原代小胶质细胞中的TGM2及p21蛋白水平进行定量分析。同时，通过免疫荧光（immunofluorescence, IF）染色观察TGM2在衰老BV2细胞中的亚细胞定位。此外，研究者还进行了六重串联质量标签（tandem mass tag, TMT）定量蛋白质组学分析，比较对照BV2细胞与衰老BV2细胞的全蛋白质组差异。

在分子机制解析层面，研究者首先通过WB检测了衰老BV2细胞中TGM2、p105、磷酸化p65（p-p65 Ser536）和IκBα的总蛋白水平，以及3月龄与20月龄小鼠嗅球、皮层和海马组织中这些蛋白的变化。随后，利用核质分离试剂盒分别提取胞浆蛋白和核蛋白，以WB检测p65、p-p65、p50、p-p50、IκBα和磷酸化IκBα（p-IκBα Ser32）在胞浆与核内的分布变化。为验证TGM2抑制剂的作用，研究者使用TGM2抑制剂Cys-D（cystamine dihydrochloride, CD）和TG2-IN1（tin1）处理衰老BV2细胞，通过WB和Airyscan免疫荧光显微镜观察NF-κB核转位的变化。为明确TGM2调控SASP的功能，研究者以RT-qPCR检测了IL-6、MMP3、MMP12、CXCL1、CXCL2、CXCL10以及p21和p53的mRNA表达水平，并构建了TGM2敲低（knockdown）的BV2细胞系（TGM2-KD）以进一步验证。在交联机制研究方面，研究者利用抗IκBα单克隆抗体富集衰老BV2细胞胞浆中的IκBα蛋白，进行非变性Western blot分析IκBα二聚体含量；将纯化的TGM2蛋白与胞浆提取物及50 μM CaCl2在37°C共孵育1小时，观察TGM2对IκBα交联的促进作用；通过AlphaFold 3.0预测IκBα二聚体的三维结构；最后利用质谱鉴定TGM2催化的IκBα共价交联位点，使用pLink2软件检索交联肽段。

在动物实验层面，研究者将16月龄C57BL/6J小鼠随机分为两组（每组n=8），实验组每两天灌胃给予200 mg/kg的Cys-D，对照组给予无菌水，持续2个月。治疗结束后2周内，依次进行转棒实验（rotarod test）、握力测试（grip strength test）、旷场实验（open-field test）和Y迷宫实验（Y-maze test）评估小鼠的运动协调能力、肌肉力量、环境适应能力和短期空间工作记忆。实验结束后，取海马组织进行WB检测TGM2、p-p65和p21的蛋白水平。

主要结果

研究首先证实TGM2在衰老小胶质细胞中高表达。IHC结果显示，老年小鼠海马CA1和CA3区域TGM2染色明显增强；WB定量分析确认老年小鼠海马中TGM2蛋白水平显著升高（p<0.05）。原代衰老小胶质细胞中TGM2和p21蛋白水平均显著高于对照（p<0.01）。在依托泊苷诱导的衰老BV2细胞中，WB显示TGM2表达极显著上调（p<0.0001），IF染色显示TGM2主要定位于胞浆。TMT定量蛋白质组学分析共鉴定到187个上调蛋白，TGM2排名第7（p<0.001），进一步在蛋白质组水平验证了TGM2的高表达。

其次，研究发现衰老小胶质细胞中NF-κB通路被激活。WB结果显示，衰老BV2细胞中TGM2和p105表达升高，p-p65（Ser536）水平上调，而IκBα蛋白水平下降。在20月龄小鼠的嗅球、皮层和海马组织中，p-p65（Ser536）水平较3月龄小鼠显著升高，证实衰老脑组织中NF-κB通路同样处于激活状态。

在TGM2抑制剂实验中，胞浆蛋白分析显示衰老BV2细胞中p-p65（Ser536）和p-IκBα（Ser32）水平升高，而Cys-D处理后胞浆中p65和IκBα蛋白含量增加，提示抑制剂阻止了IκBα的降解和NF-κB的释放。核蛋白分析显示，衰老BV2细胞核内p65、p-p65（Ser536）和p50水平升高，而Cys-D处理降低了核内p65、p50和p-p50（Ser337）水平。Airyscan免疫荧光进一步证实，衰老小胶质细胞中p65核转位增强，而TG2-IN1和Cys-D均可减弱这一现象。

在SASP调控实验中，SA-β-gal染色显示衰老BV2细胞呈现增大形态和阳性染色，Cys-D处理可减少衰老细胞。RT-qPCR结果显示，衰老BV2细胞中IL-6、MMP3、MMP12、CXCL1、CXCL2和CXCL10的mRNA水平上调，Cys-D处理可显著降低这些SASP因子的表达，同时也降低了p21和p53的mRNA水平。TGM2敲低实验进一步证实，敲低TGM2可显著降低衰老BV2细胞中IL-6、MMP3和CXCL1的表达，与抑制剂实验结果一致。

在交联机制解析方面，非变性WB显示衰老BV2细胞胞浆中IκBα二聚体含量显著高于对照细胞。体外共孵育实验证明，纯化的TGM2蛋白可促进胞浆中IκBα交联形成二聚体，同时减少非交联IκBα的含量。AlphaFold 3.0结构预测显示IκBα二聚体呈中心对称构型。质谱分析成功鉴定出TGM2催化的IκBα共价交联位点为K22和Q248残基。这些结果表明，TGM2通过催化IκBα在K22和Q248残基处形成共价交联，导致IκBα二聚化，降低胞浆中游离IκBα浓度，从而促进NF-κB核转位和SASP的持续表达。

在动物实验中，Cys-D治疗组小鼠体重先下降后趋于稳定，毛发变得光泽，脱毛状况明显改善。转棒实验中，Cys-D治疗组特别是雌性小鼠的停留时间增加了约20%。握力测试显示雌性小鼠握力增加超过20%，而雄性小鼠握力无明显变化。旷场实验和Y迷宫实验结果表明，Cys-D改善了老年小鼠对新环境的适应能力和空间记忆能力。海马组织WB分析显示，Cys-D治疗显著降低了TGM2、p-p65和p21的蛋白水平，表明Cys-D可能通过抑制海马区小胶质细胞中的TGM2活性来减轻神经炎症并延缓脑衰老。

结论与意义

本研究揭示了TGM2在衰老小胶质细胞中通过催化IκBα的K22和Q248残基共价交联、形成IκBα二聚体，从而降低胞浆中功能性IκBα浓度，促进NF-κB核转位并驱动SASP持续产生的分子机制。TGM2、NF-κB和SASP之间构成了一个正反馈环路：NF-κB激活上调TGM2表达，TGM2通过交联IκBα进一步激活NF-κB，促进IL-6等SASP因子的释放，而这些炎性因子又可通过IL-6R/p-STAT3等通路促进TGM2表达。这一环路在衰老小胶质细胞中维持并放大神经炎症。

该研究的科学价值在于首次阐明了TGM2在衰老小胶质细胞中通过非经典途径激活NF-κB的具体分子机制，即通过酶催化共价交联而非传统磷酸化-泛素化降解途径来调控IκBα的功能。在应用价值方面，TGM2抑制剂Cys-D被证明可有效降低衰老小胶质细胞的SASP水平，并在老年小鼠中改善脱毛、运动协调、空间记忆等衰老表型，表明TGM2可作为抗衰老的潜在靶点，TGM2抑制剂有望成为新型预防药物或衰老形态调节剂用于神经退行性疾病的干预。

研究亮点

本研究的亮点包括：第一，通过TMT定量蛋白质组学、体内外多模型验证和基因敲低等多层次证据首次系统证明了TGM2在衰老小胶质细胞中的高表达和功能重要性。第二，利用非变性WB、体外酶促交联实验、AlphaFold 3.0结构预测和质谱交联位点鉴定等技术，首次在细胞水平确定了TGM2催化IκBα在K22和Q248残基处形成共价交联的精确位点。第三，提出了TGM2-NF-κB-SASP正反馈环路作为衰老小胶质细胞持续分泌炎性因子的核心机制。第四，通过口服Cys-D的动物实验验证了TGM2抑制剂作为衰老形态调节剂的体内有效性和安全性，为转化应用提供了直接实验依据。