针对肝细胞癌仑伐替尼耐药新机制的深度研究报告
本研究题为《METTL3-m6A-EGFR轴驱动肝细胞癌的仑伐替尼耐药》，由中山大学附属第一医院精准医学研究院、肿瘤中心、临床研究部等多个部门的研究人员共同完成。通讯作者为Shuibin Lin、Manling Huang和Lixia Xu。该研究于2023年3月在线发表于《Cancer Letters》杂志第559卷。
一、 研究的学术背景与研究目标 本研究聚焦于肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）的靶向治疗耐药性这一临床与科学难题。肝细胞癌是全球范围内发病率与死亡率均极高的恶性肿瘤。仑伐替尼（Lenvatinib）作为一种多激酶抑制剂，已被批准为晚期HCC的一线治疗药物，其疗效优于索拉非尼。然而，无论是内在性还是获得性耐药，都严重限制了仑伐替尼的长期疗效，导致患者复发和转移。目前，临床上缺乏能够预测仑伐替尼疗效的可靠生物标志物，也缺少能够克服其耐药性的有效药物。因此，深入探究仑伐替尼耐药的分子机制，对于开发更有效的HCC治疗策略至关重要。
近年来，表观遗传修饰在肿瘤发生发展和治疗抵抗中的作用日益受到关注。其中，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine， m6A）是真核生物信使RNA上最丰富、最普遍的转录后修饰。m6A修饰是一个动态可逆的过程，由“写入”蛋白（Writer，如METTL3-METTL14复合物）、“擦除”蛋白（Eraser，如FTO、ALKBH5）和“阅读”蛋白（Reader，如YTHDF家族）协同调控。越来越多的证据表明，m6A修饰在调节肿瘤干细胞特性、以及对化疗和靶向药物的耐药性中扮演关键角色。然而，m6A修饰在仑伐替尼耐药中的作用尚属未知。
基于此背景，本研究旨在探究m6A修饰在肝细胞癌仑伐替尼耐药中的调控作用及其潜在分子机制。具体目标包括：1. 明确m6A修饰水平及关键调控因子在仑伐替尼耐药HCC细胞中的变化；2. 通过遗传学和药理学手段干预METTL3，评估其对仑伐替尼敏感性的影响；3. 利用多种小鼠HCC模型，验证靶向METTL3能否在体内克服仑伐替尼耐药；4. 阐明METTL3-m6A轴调控耐药的分子机制，寻找下游关键靶点。
二、 详细研究流程 本研究设计严谨，流程环环相扣，涵盖了从细胞模型构建、分子机制探索到体内动物模型验证的完整链条。
1. 研究模型的建立与初步表型分析 研究首先构建了仑伐替尼耐药细胞模型。通过将Huh7和Hep3B肝癌细胞长期暴露于浓度递增的仑伐替尼中，成功建立了获得性耐药细胞系，分别命名为Huh7-LR和Hep3B-LR。与亲本细胞相比，耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）显著升高，在仑伐替尼处理下的细胞活力更强，克隆形成能力也更高。此外，研究还使用了已报道的原发性耐药细胞系MHCC97H。为了探究临床相关性，研究纳入了74例在中山大学附属第一医院接受仑伐替尼辅助治疗的HCC患者组织样本，用于后续免疫组化分析。同时，研究还利用了前期建立的HCC患者来源类器官模型，以评估其与临床耐药的相关性。
2. m6A修饰水平检测与关键调控因子鉴定 利用RNA m6A斑点印迹技术，研究者发现，与亲本细胞相比，Huh7-LR耐药细胞中的总体m6A修饰水平显著上调。为了找出导致这一变化的关键“写入”蛋白，他们通过蛋白质印迹法检测了多个m6A调控因子（包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1）的表达水平。结果显示，在所有检测的蛋白中，METTL3在Huh7-LR和Hep3B-LR细胞中的上调最为显著。这一发现在临床样本中得到了印证：对患者组织进行免疫组化染色分析发现，仑伐替尼耐药患者的肿瘤组织中METTL3蛋白表达水平显著高于敏感患者；在患者来源类器官对应的肿瘤组织中，类器官耐药的病例其METTL3表达也更高。Kaplan-Meier生存分析进一步显示，METTL3高表达与患者较短的总生存期相关。这些结果共同指向METTL3介导的m6A修饰可能在HCC仑伐替尼耐药中扮演重要角色。
3. 功能验证：METTL3调控仑伐替尼敏感性的作用 为了验证METTL3的功能，研究者在原发耐药细胞MHCC97H和获得性耐药细胞Huh7-LR中，分别使用两种独立的短发夹RNA敲低了METTL3的表达。功能实验表明，在仑伐替尼存在的情况下，敲低METTL3能够显著抑制两种耐药细胞的增殖（通过细胞生长曲线和克隆形成实验评估），并诱导细胞凋亡增加（通过流式细胞术检测Annexin V/PI双染）。更重要的是，研究采用了METTL3的特异性小分子抑制剂STM2457进行药理学干预。体外实验显示，仑伐替尼单药或STM2457单药对耐药细胞的抑制效果有限，但两者联合使用时，能够协同发挥强大的抗肿瘤效果，表现为细胞增殖被更强抑制、克隆形成能力急剧下降以及凋亡细胞比例大幅上升。
4. 机制探索：寻找METTL3-m6A轴的下游靶点 为了阐明METTL3如何导致耐药，研究者进行了m6A甲基化RNA免疫共沉淀测序。该技术能够在全基因组范围内定位RNA上的m6A修饰位点。他们将MHCC97H细胞用STM2457或DMSO处理72小时后进行MeRIP-seq分析。结果显示，STM2457处理显著降低了m6A修饰水平，尤其是位于mRNA 3‘非翻译区的修饰峰。对修饰水平下降的基因进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析发现，这些基因显著富集于TGF-β信号通路和ERBB信号通路。考虑到ERBB家族成员EGFR已被报道与HCC的仑伐替尼耐药有关，研究者将EGFR锁定为候选靶点。测序数据证实，EGFR mRNA的3‘UTR区域确实存在m6A修饰峰，且该修饰在STM2457处理后减弱。 为了验证m6A修饰是否影响EGFR的表达，研究者进行了核糖体新生链复合物qPCR实验，这是一种评估mRNA翻译效率的方法。结果显示，无论是敲低METTL3还是使用STM2457抑制其活性，都会降低EGFR mRNA的翻译效率。相应地，EGFR的蛋白表达水平及其下游信号通路关键分子ERK1/2和MEK1/2的磷酸化水平也随之下降。相反，过表达METTL3则能增加EGFR及其下游信号通路的活性。最后的“拯救”实验进一步证实了EGFR的关键作用：在敲低METTL3的MHCC97H细胞中重新过表达EGFR，可以部分逆转由METTL3敲低导致的细胞增殖抑制、克隆形成减少和凋亡增加，从而恢复了细胞对仑伐替尼的抵抗能力。这些证据链清晰地表明，EGFR是METTL3-m6A轴下游的关键效应分子，METTL3通过以m6A依赖的方式促进EGFR mRNA的翻译，进而激活下游促生存信号通路，最终导致仑伐替尼耐药。
5. 体内验证：STM2457在多种小鼠模型中克服仑伐替尼耐药 为了评估靶向METTL3的临床转化潜力，研究者在四种不同类型的小鼠HCC模型中系统验证了STM2457与仑伐替尼的联合疗效。 （1）皮下移植瘤模型：将MHCC97H细胞注射到裸鼠皮下成瘤。结果显示，仑伐替尼或STM2457单药仅能轻微抑制肿瘤生长，而两药联用则能显著缩小肿瘤体积和重量。肿瘤组织分析显示，联合治疗组的细胞增殖标志物Ki67表达降低，凋亡标志物TUNEL阳性细胞增多，EGFR表达也下调。 （2）肝内异种移植瘤模型：为了模拟肿瘤的肝脏微环境，将皮下瘤的瘤块移植到NCG免疫缺陷小鼠的肝脏内。在此模型中，联合治疗同样表现出优于任一单药的抗肿瘤效果，显著降低了肝脏肿瘤负荷。 （3）原位移植瘤模型：为了在具有完整免疫系统的小鼠中评估疗效，将鼠源肝癌细胞Hepa1-6原位注射到C57