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研究报告：《EpiDome：一种用于评估表皮葡萄球菌定植和感染的种群结构与异质性的物种特异性方法》

主要作者及发表信息 本研究由丹麦国家血清研究所（Statens Serum Institut）的Amalie Katrine Rendboe、Thor Bech Johannesen、Anna Cäcilia Ingham、Søren Iversen、Sharmin Baig、Sofie Edslev、Jørgen Skov Jensen、Paal Skytt Andersen和Marc Stegger，以及瑞典厄勒布鲁大学（Örebro University）的Emeli Månsson和Bo Söderquist共同完成。通讯作者为Marc Stegger。该研究成果于2020年发表在开放获取期刊《BMC Microbiology》上。

研究背景 凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-negative staphylococci, CoNS）通常被认为是与宿主存在良性或共生关系的人体皮肤和黏膜共生菌。然而，表皮葡萄球菌（*Staphylococcus epidermidis*）作为一种重要的机会性病原体，近年来引起了广泛关注。它已成为与异物材料相关（如人工关节感染，Prosthetic Joint Infections, PJIs）以及在免疫功能低下患者（如早产儿和血液系统恶性肿瘤患者）中引发院内感染的主要病原体，导致了巨大的经济成本并严重影响患者的生活质量。尤其值得关注的是，医院环境中的表皮葡萄球菌分离株对抗生素的耐药性问题日益严峻，诸如耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin-resistant S. epidermidis, MRSE）以及多重耐药表皮葡萄球菌（Multidrug-resistant S. epidermidis, MDRSE）谱系（如序列型ST2、ST5、ST23和ST215）正在全球范围内传播。区分真正的感染和污染是一项挑战，且研究提示，无论是在健康携带者还是在感染患者中，表皮葡萄球菌在亚种水平上均表现出高度的异质性（heterogeneity），这与金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）群落的高度克隆性形成鲜明对比。然而，现有的研究方法，如培养和表征多个分离株，过程耗时费力，而宏基因组学（metagenomics）测序方法则成本高昂。因此，本研究旨在开发一种基于扩增子测序（amplicon sequencing）的、不依赖于培养的新方法——EpiDome，以直接从初级样本（primary samples）中获取超越物种水平的信息，阐明表皮葡萄球菌群落的克隆性（clonality）、种群结构、时间稳定性或生态位选择。

研究流程与方法 为实现上述目标，研究者设计并执行了一项包含多个关键步骤的综合研究方案。

首先，研究者构建并分析了表皮葡萄球菌的种群结构，以识别能够区分不同谱系的基因靶点。研究纳入了来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）参考序列数据库（RefSeq）的553个基因组组装体，以及来自瑞典的一项关于人工关节感染的近期研究中产生的289个经SPAdes组装的基因组，总计842个基因组。利用Northern Arizona SNP Pipeline (NASP)，研究者比对核心基因组，获得了86,139个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs），并基于这些SNPs的成对差异，通过完全连接层次聚类（hierarchical clustering），定义了130个克隆群，并将它们归类到各自最普遍的序列型。

其次，研究者进行了扩增子靶点的识别与聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）引物设计。在50个代表核心基因组多样性的分离株中，通过Prokka和Roary软件分析，识别出核心基因。随后，研究者在全基因组范围内筛选具有高度可变区域（用于区分谱系）且两侧序列保守（适合作为引物结合位点）的基因。经评估后，选定两个靶点：g216基因作为主要靶点，提供高分辨率；yych基因作为次要靶点，以增强对特定关键院内感染谱系的识别能力。针对这两个靶点分别设计了特异性引物，并随后将其组合成双重PCR。为了定量分析，研究者还针对g216基因设计了用于荧光定量PCR（qPCR）的MGB探针。

第三，研究者对该方法进行了全面的验证。特异性验证使用了代表15个克隆群的26株表皮葡萄球菌分离株、27种其他葡萄球菌物种以及21种其他常见皮肤共生菌的DNA。方法的重现性和灵敏度则通过构建两种基因组模拟群落（mock communities）来评估：一种为“均匀模拟群落”，包含等量（10,000拷贝）的ST2、ST5、ST14、ST87、ST215和ST218六种序列型菌株；另一种为“梯度模拟群落”，包含不同拷贝数的相同菌株，以模拟真实样本中不同丰度的情况。这些模拟群落样本执行了三次技术重复。

第四，将该方法应用于一组来自丹麦哥本哈根11名健康社区居民的初级样本。每位参与者同时采集了前鼻孔（anterior nares）和前臂皮肤（volar forearm or antecubital fossa）的拭子样本，共计22份。所有样本均进行了技术重复处理。样本经酶解前处理后，用Magna Pure 96自动提取DNA，随后进行双重PCR扩增、索引PCR建库，最后在Illumina MiSeq平台上使用600-cycle v3试剂盒进行测序。与此同时，所有样本也应用了qPCR进行g216基因的绝对丰度定量。

最后，研究者建立了专门的生物信息学分析流程。使用cutadapt软件裁剪引物序列，然后利用R软件包DADA2进行质量过滤、Illumina错误模型估计、扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variants, ASVs）推断及嵌合体去除。本研究的关键创新之一是构建了自定义的分类学数据库，该数据库包含了842个表皮葡萄球菌基因组中所有独特的g216和yych靶点序列。分类时，首先以g216序列为首要标识符进行匹配，若g216序列匹配多个克隆群，则辅以yych序列信息进行分辨。无法解决的ASVs归类为“未分类”（unclassified），数据库中没有的序列归类为“新序列”（novel）。所有分析脚本和数据库均在GitHub上公开。

主要研究结果 EpiDome方法在方法学验证中展现了卓越的性能。双重PCR的特异性测试结果显示，g216引物对表现出完全的物种特异性，而yych引物仅对少数非表皮葡萄球菌物种有非特异性扩增，但这些物种的产物序列与表皮葡萄球菌截然不同，不会干扰下游分析。对模拟群落样本的分析证实，该方法具有极高的灵敏度，即使丰度低至100拷贝/μL的序列型也能被成功检测，且技术重复之间具有高度可重复性。研究还确定了在现有测序深度下，可靠的检测灵敏度约为1%，并指出了测序错误导致的背景噪音水平（通常低于2%），为后续样本的数据解读提供了重要依据。

将该方法应用于22份人体初级样本后，获得了丰富的关于表皮葡萄球菌定植异质性的数据。测序数据显示，22个样本中有20个（91%）为表皮葡萄球菌阳性。总体而言，样本表现出高度的个体间异质性（high degree of inter-sample heterogeneity）。每个样本平均包含5个不同的克隆群，最多可达8个。大部分测序读数（76%）集中分布于10个主要的克隆群中，包括研究中特别关注的ST2、ST5和ST215等院内感染相关谱系。重要的是，约18%的ASVs被归类为“新序列”（13%）或“未分类”（5%），这提示自然界中表皮葡萄球菌的多样性可能远超现有数据库中分离株所代表的范围。

主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示，皮肤和鼻腔样本的表皮葡萄球菌种群存在重叠，但样本间整体β多样性（beta-diversity）较高。值得注意的是，技术重复的样本在主成分分析图上紧密聚类，再次验证了EpiDome方法的优异可重复性。

qPCR结果补充了扩增子测序的组成学数据，提供了表皮葡萄球菌的绝对丰度信息。qPCR标准曲线的决定系数（R²）高达0.99，跨越7个对数级稀释梯度，检测限低于10拷贝/μL。在初级样本中，表皮葡萄球菌数量范围从2至962拷贝/μL不等，鼻腔样本的带菌量普遍高于皮肤样本。对于绝对丰度极低的样本，技术重复间的变异程度会增大。通过结合测序得到的相对丰度与qPCR得到的绝对丰度，研究者能够更全面地描绘样本中表皮葡萄球菌的群落特征。

研究结论与价值 本研究成功设计并验证了一种名为EpiDome的创新方法，该方法将靶向扩增子测序与qPCR相结合，能够从初级样本中快速获取表皮葡萄球菌的定量信息和亚种水平的分型信息。其科学价值在于为研究这个日益重要的院内病原体提供了一种强大的新工具，能够在无需耗时培养或昂贵宏基因组测序的情况下，解答关于种群动力学、社区异质性和生态位选择等一系列关键科学问题。其应用价值体现在可直接用于检测和区分样本中重要的多重耐药院内感染谱系（如ST2、ST5和ST215），这对于监测病原体的出现和传播、指导感染控制措施具有重要的临床意义。此外，研究中发现的约10%的未知变异体凸显了现有基因组数据库的不完整性以及扩大测序工作的必要性。研究者已将完整的分析流程、数据库和文档资料公开，以便全球科学家使用该方法。

研究亮点 本研究的亮点主要体现在以下几个方面。首先，方法的核心创新：研究者巧妙地仅利用两个核心基因靶点（g216和yych）的组合，通过自定义分类算法，即实现了对表皮葡萄球菌整个种群结构的高分辨率区分，克服了该物种因高频重组而难以分型的挑战。其次，研究对象的特殊性：该方法不仅适用于纯培养分离株，其设计初衷和验证过程均直接面向初级样本（皮肤和鼻腔拭子），能够处理低生物量（low-biomass）和高度异质性的样本，真实反映了体内的群落状态。最后，方法学的严谨性：从大规模基因组学数据挖掘、到全面的实验验证（包括特异性和灵敏度）、再到强大的生物信息学流程建立，研究形成了一个完整闭环，确保了方法的准确性和可靠性，其公开透明的设计也为后续研究树立了良好典范。