关于TIL疗法在黑色素瘤中临床反应背后肿瘤反应性T细胞克隆型动态的研究报告

本文旨在向中文研究者同行介绍一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocyte, TIL）疗法的重要研究。这项研究由瑞士洛桑大学路德维希癌症研究所的Johanna Chiffelle、David Barras、Alexandre Harari及George Coukos等研究人员共同完成，并于2024年10月8日发表在免疫学顶级期刊《Immunity》上（卷57，页码2466-2482，文章链接为https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.08.014）。

学术背景与研究目的

研究领域属于肿瘤免疫学与过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapy, ACT）。具体而言，该研究聚焦于使用体外扩增的TILs来治疗转移性黑色素瘤的ACT。尽管TIL-ACT疗法对一些患者显示出治愈潜力，但其临床反应具有不一致性，大量患者未能从中获益。影响疗效的限制因素，长期以来被认为与来源肿瘤中肿瘤特异性T细胞的稀缺、细胞终末分化或输注后细胞持久性不足等有关。尽管单细胞测序技术已揭示了实体瘤内肿瘤特异性T细胞的耗竭/功能失调特征，但这些细胞状态如何在TIL-ACT的体外扩增、体内回输及肿瘤定植过程中发生动态变化，并最终影响临床结局，尚不清楚。

因此，本研究旨在通过高分辨率追踪T细胞克隆型在TIL-ACT全过程中的动态变化，深入探究决定治疗成功与否的决定性因素。研究目标是阐明与临床反应相关的肿瘤特异性T细胞克隆型的特征、动态及细胞状态重编程，从而为理解TIL-ACT的机制和未来治疗优化提供关键见解。

详细研究流程

本研究是一项基于临床患者队列的深度纵向分析，具体流程如下：

1. 临床队列与样本收集： 研究基于一项I期临床试验（NCT03475134），纳入13名接受TIL-ACT治疗的转移性黑色素瘤患者。根据实体瘤疗效评价标准（RECIST），其中6名患者被定义为应答者（Responders，包括完全缓解和部分缓解），7名患者为非应答者（Non-Responders，包括疾病稳定和疾病进展）。研究系统地收集了每位患者的关键时间点样本，包括：基线期的肿瘤样本和血液样本、体外扩增制备的ACT产品样本、以及ACT治疗后第30天的肿瘤和血液样本。

2. 高通量深度分析技术的综合运用：

   • 单细胞多组学分析： 对上述时间点的T细胞进行了整合的单细胞RNA测序和T细胞受体测序，共分析了超过12.2万个T细胞。该技术能够同时获得单个T细胞的基因表达谱和其唯一的TCR克隆型信息。
   • 大样本量TCR克隆型追踪： 通过bulk TCR测序，跨越所有时间点追踪了超过280万个TCR克隆型的丰度和分布动态。
   • 功能验证与克隆分离： 建立了快速体外肿瘤反应性检测实验。将ACT产品与患者自体的肿瘤细胞共培养，通过CD137的上调来识别和分选肿瘤反应性TILs。此外，研究人员构建了一个包含249个独特CD8+ T细胞克隆型的TCR文库，通过基因工程手段克隆其TCR α/β链，并在报告细胞系或T细胞中表达，以逐一验证其对自体肿瘤细胞的反应性。
   • 多组学整合： 在部分样本中，还应用了单细胞RNA测序与转座酶可及染色质测序的多组学技术，以探究表观遗传层面的变化。

3. 核心分析工作流程：

   • 克隆型来源与动态分析： 利用TCR序列作为“条形码”，追踪单个克隆型从基线肿瘤到ACT产品，再到治疗后体内（血液和肿瘤）的路径。计算克隆型的富集率、转移率和定植率，并比较应答者和非应答者之间的差异。
   • 肿瘤反应性特征构建： 基于那些经过功能验证的肿瘤反应性和非反应性CD8+ T细胞的单细胞转录组数据，研究人员构建了一个定制的“肿瘤反应性特征”。该特征包含了CXCL13, PDCD1, TOX, LAG3等与T细胞耗竭和功能相关的基因。利用该特征对大量未经验证的CD8+ T细胞克隆型进行预测性评分，将其分为高、中、低肿瘤反应性状态，从而实现了对肿瘤内和ACT产品中肿瘤反应性T细胞群的大规模、无偏倚评估。
   • 细胞状态与功能分析： 基于单细胞转录组数据，将T细胞注释为不同的功能状态，如耗竭前体细胞、终末耗竭细胞、效应记忆样细胞、干扰素刺激基因高表达细胞等。分析这些状态在基线、ACT产品和治疗后肿瘤中的分布变化，并将细胞状态与克隆型动态、肿瘤反应性关联起来。
   • 表观遗传重编程分析： 通过单细胞ATAC-seq数据，分析体外扩增前后T细胞在染色质可及性层面的变化，特别是与耗竭相关的表观遗传“疤痕”是否被清除。

主要研究结果

本研究取得了多层次、相互印证的突破性发现，详细结果如下：

1. ACT产品组成决定了临床反应： 结果发现，应答者与非应答者的ACT产品在细胞组成上存在根本差异。

   • 应答者的产品富含肿瘤来源的CD8+ T细胞： 应答者的ACT产品中CD8+ T细胞比例和CD8/CD4比值显著更高。更重要的是，通过TCR追踪发现，应答者ACT产品中大部分CD8+克隆型来源于基线肿瘤中的TILs，并且肿瘤内丰度最高的克隆型能更有效地被动员并扩增进入产品中。这意味着应答者的肿瘤本身就“预存”了丰富的、易于扩增的肿瘤反应性T细胞资源。
   • 非应答者的产品则被血液来源的CD4+ T细胞主导： 相反，非应答者的ACT产品中，大部分克隆型来自血液循环（基线血液中存在但肿瘤中未检测到），尤其是CD4+ T细胞（包括调节性T细胞和γδ T细胞）。这些血液来源的克隆型虽然能在体外扩增，但其肿瘤靶向性存疑。

2. 肿瘤反应性T细胞的输注量与多克隆性是关键预测因子：

   • 定量验证： 通过CD137上调实验直接检测，应答者ACT产品中肿瘤反应性CD8+ T细胞的绝对输注数量显著高于非应答者。该指标能非常准确地预测临床反应。
   • 克隆多样性： 利用构建的肿瘤反应性特征进行推断，研究发现应答者基线肿瘤中预测为肿瘤反应性的CD8+ T细胞克隆型数量和频率都远高于非应答者。这直接转化到ACT产品中：应答者输注的是一个高度多克隆的肿瘤特异性T细胞库（平均每个产品包含123个独特的肿瘤反应性克隆型），而非应答者输注的肿瘤反应性细胞数量极少且克隆型单一。这首次在分子层面揭示了TIL-ACT产品肿瘤特异性的多克隆性规模及其与疗效的关系。

3. 治疗后T细胞的体内命运截然不同：

   • 应答者中，肿瘤来源的克隆型优先定植于肿瘤： 输注后第30天，在应答者的肿瘤中，成功定植的T细胞主要来源于ACT产品中的肿瘤源性克隆型（即基线肿瘤中存在的克隆型）。这些细胞有效地“归巢”并重新浸润了肿瘤。
   • 非应答者中，血液来源的克隆型异常浸润肿瘤： 而在非应答者的治疗后肿瘤中，却发现了大量来自ACT产品中血液源性克隆型的浸润。这可能代表了非特异性或无效的炎症浸润，无法介导有效的抗肿瘤反应。
   • 肿瘤反应性克隆的体内之旅： 追踪已验证的肿瘤反应性克隆型发现，在应答者中，这些细胞在输注后既能在外周血中持续存在，又能高效地浸润肿瘤；而在非应答者中，它们的肿瘤定植能力极差。

4. T细胞在体外扩增过程中发生功能性“重振”：

   • 耗竭特征的丢失： 单细胞转录组和表观遗传分析显示，无论T细胞在基线肿瘤中处于何种状态（包括耗竭状态），经过IL-2驱动的体外扩增后，其耗竭相关的基因表达特征（如TOX, PDCD1, LAG3等）和表观遗传“疤痕”均显著减弱或丢失。
   • 效应功能的获得： 与此同时，扩增后的T细胞上调了与细胞毒性（如颗粒酶、穿孔素）和增殖相关的基因，呈现出一种“重振”的效应状态。这种重编程在应答者中尤为明显。

5. 应答者在治疗后肿瘤中重建“中间耗竭-效应”状态：

   • 当这些经过体外“重振”的肿瘤特异性T细胞回输到应答者体内并重新浸润肿瘤后，它们会再次遇到肿瘤抗原。研究发现，此时这些细胞重新上调了部分耗竭相关分子（如TOX, LAG3），但水平低于基线肿瘤中的状态。
   • 更重要的是，它们同时维持并进一步增强了在体外获得的效应功能和增殖特征，表达更高水平的IFN-γ、颗粒酶A、CD69等。这种独特的、兼具部分耗竭特征和强大效应功能的“中间耗竭-效应”状态，被认为是驱动肿瘤消退的功能性细胞状态。而在非应答者的治疗后肿瘤中，未观察到这种有利的状态转变。

结论与意义

本研究得出以下核心结论：TIL-ACT的临床成功取决于一个完整的“链条”——患者基线肿瘤中必须预存有丰富且可被有效动员的肿瘤反应性T细胞克隆型；这些克隆型在体外IL-2扩增中能发生功能性重振，丢失耗竭特征，获得效应能力；回输后，它们能有效归巢至肿瘤，并在抗原刺激下重建一种兼具效应活性和部分耗竭特征的有利状态，从而介导持续的肿瘤杀伤。反之，治疗失败则与基线肿瘤缺乏肿瘤反应性T细胞、ACT产品被无关的血液来源克隆型“污染”、以及输注细胞无法在肿瘤中建立功能性免疫微环境有关。

科学价值与应用前景： 1. 机制深度解析： 该研究首次以单细胞分辨率和克隆型追踪的精度，全景式描绘了TIL-ACT全过程中肿瘤反应性T细胞的动态变化、状态重编程及其与临床结局的因果关系，将领域认知提升到新的水平。 2. 潜在生物标志物： 研究指出了多个潜在的预测性生物标志物，包括基线肿瘤中肿瘤反应性TILs的丰度和状态、ACT产品中肿瘤反应性CD8+ T细胞的绝对数量和多克隆性、以及产品中肿瘤源性 vs. 血液源性克隆型的比例。这些标志物可用于优化患者筛选。 3. 治疗优化启示： 研究为改进TIL-ACT提供了明确方向，例如：开发新的体外扩增方案以更好地保留和扩增肿瘤特异性T细胞，尤其是那些具有干细胞样特性的耗竭前体细胞；避免扩增无关的血液来源细胞；考虑联合使用免疫检查点抑制剂，以维持回输后T细胞在肿瘤中的效应功能，防止其过度耗竭。

研究亮点

1. 系统性纵向追踪： 跨越基线肿瘤、ACT产品、治疗后血液和肿瘤多个时间点的系统性样本采集与分析，构成了一个完整的动态研究框架。
2. 多组学与功能验证的深度融合： 巧妙地将高通量单细胞测序、克隆型追踪、体外功能实验和TCR克隆验证相结合，使宏观发现均有微观功能数据支撑，结论坚实可靠。
3. “肿瘤反应性特征”的构建与应用： 自建的特征模型使得能够对大量未经验证的T细胞进行肿瘤反应性预测，极大地扩展了分析视野和结论的普适性。
4. 揭示关键细胞状态动态： 明确提出了TIL在体外经历“功能性重振”，并在应答者体内重建“中间耗竭-效应”状态这一核心生物学过程，为理解ACT的作用机制提供了关键概念。
5. 明确区分克隆型来源： 清晰地区分了“肿瘤源性”和“血液源性”克隆型，并证明其不同的体内命运和对疗效的相反贡献，这是一个重要而清晰的发现。

其他有价值的内容

研究还讨论了与免疫检查点抑制剂治疗失败患者的关联，指出TIL-ACT能够成功重振一部分对PD-1抑制剂无效的T细胞，这为其在后续线治疗中的应用提供了理论依据。同时，作者也指出了研究的局限性，如患者队列规模较小、无法完全排除罕见干细胞样群体贡献的可能性等，体现了科学的严谨性。最后，研究将发现与CAR-T细胞疗法的相关研究进行了类比，指出在过继性细胞疗法领域存在一些共通的规律（如输注细胞数量、持久细胞表型等），有助于形成更广泛的免疫治疗理论框架。