关于乙酰化甘露聚糖ABPA1通过线粒体途径诱导结直肠癌细胞凋亡的学术研究报告
一、 研究作者、机构及发表信息
本研究由Tong Xueli、Lao Chunqin、Li Di、Du Junxi、Chen Jingmian、Xu Weijie、Li Lu、Ye Huiling、Guo Xiaofeng（通讯作者）和Li Jiejing（通讯作者）共同完成。主要研究机构为位于中国广州的Biotech&Science Company of UP, Ltd.的研发部，以及广州第一人民医院、华南理工大学医学院的消化内科。该研究成果以题为“An acetylated mannan isolated from Aloe vera induce colorectal cancer cells apoptosis via mitochondrial pathway”的论文形式，发表于国际学术期刊《Carbohydrate Polymers》第291卷（2022年），文章识别号为119464，已于2022年4月8日在线发布。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于天然产物化学与肿瘤药理学交叉领域，聚焦于植物多糖的抗肿瘤活性及其分子机制探索。
学术背景： 结直肠癌是全球发病率第三高的恶性肿瘤，具有高发病率、高死亡率和高肝转移率的特点，亟需寻找新的、安全高效的抗肿瘤药物。植物来源的多糖因其低毒性和多种生物活性（如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等），已成为抗癌药物研发的重要方向。例如，茯苓多糖、香菇多糖、人参多糖和云芝多糖（PSK）等已在临床作为癌症辅助治疗剂使用。然而，这些多糖的应用大多局限于免疫调节或减轻放化疗副作用，直接靶向肿瘤细胞的机制尚不明确。芦荟凝胶提取物AVBEC（Aloe vera barbadensis extract C）在前期研究中被证明具有选择性杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞的活性，但其具体功能成分和作用机制尚未阐明。芦荟多糖是芦荟的主要活性成分之一，其中乙酰化甘露聚糖（Acemannan）研究较多，但其精确的抗癌机制，特别是是否直接作用于肿瘤细胞内的关键细胞器，仍有待揭示。线粒体作为细胞的能量工厂和凋亡调控中心，在肿瘤细胞的代谢重编程中扮演关键角色，是潜在的抗癌药物靶点。
研究目的： 本研究的核心目标是：1）从AVBEC中分离纯化出均一的多糖组分；2）评估该纯化多糖对结直肠癌的抗肿瘤效果；3）深入阐明其诱导癌细胞凋亡的具体分子机制，特别是是否通过线粒体途径发挥作用；4）探究该多糖对肿瘤细胞线粒体代谢的影响。
三、 详细研究流程
本研究是一个系统性的实验工作，从活性成分的分离鉴定，到体外细胞水平的功能与机制验证，再到体内动物模型的疗效评估，流程完整。
1. 多糖的分离、纯化与结构鉴定 * 研究对象与样本： 以芦荟凝胶提取物AVBEC为起始原料。 * 处理流程： * 粗提： 向AVBEC中加入三倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心收集粗多糖。 * 纯化： 将粗多糖溶液置于3500 Da的透析袋中流水透析48小时以去除小分子杂质，随后冻干。将溶解后的多糖依次上样至DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Superdex-200凝胶过滤柱进行纯化，得到均一多糖组分AP-1。 * 结构表征： * 分子量测定： 采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC），使用已知分子量的葡聚糖标准品绘制标准曲线，计算得出AP-1的重均分子量约为360，010 Da，数均分子量约为207，965 Da。色谱图显示单一对称峰，表明其为均一多糖。 * 单糖组成分析： 采用离子色谱法（HPLC）分析酸水解后的产物。结果显示AP-1主要由甘露糖（89.5%）、葡萄糖（6.1%）、半乳糖（3.6%）和阿拉伯糖（0.8%）构成。 * 糖苷键分析： 通过甲基化反应结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。结果显示，AP-1中主要糖苷键类型为→4)-Manp-(1→，占比高达87.8%，这与单糖组成以甘露糖为主的结果一致。 * 核磁共振（NMR）分析： 运用一维（1H NMR， 13C NMR）和二维（HSQC， COSY， HMBC）核磁共振技术解析多糖精细结构。谱图信号表明AP-1主要由己糖单元构成，并在δC 174.1和20.5处出现了乙酰基的特征信号，证明该甘露聚糖被高度乙酰化。综合GC-MS和NMR数据，最终确定AP-1是一种乙酰化甘露聚糖，并将其命名为ABPA1（Aloe barbadensis Polymeric Acemannan 1），其主要结构骨架为→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→，乙酰基随机分布在甘露糖的O-2、O-3和O-6位。
2. 体外细胞实验：ABPA1诱导结直肠癌细胞凋亡及其机制探究 * 研究对象： 人结直肠癌细胞系RKO和SW480，以及小鼠结直肠癌细胞系MC38（用于后续体内实验）。 * 剂量设计： 根据AVBEC中多糖含量（约200 μg/mL等效于10 mg/mL AVBEC）及文献常用浓度，体外实验ABPA1使用浓度为200 μg/mL。 * 主要实验流程与分析方法： * 细胞凋亡检测： 使用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞术定量分析ABPA1处理不同时间（2， 4， 8小时）后RKO和SW480细胞的凋亡率。同时设置AVBEC处理组（10 mg/mL， 8小时）进行对比。 * 凋亡相关蛋白表达分析： 采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测ABPA1处理不同时间后，细胞中Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、细胞色素c（Cyto-c）等蛋白的表达水平。 * 细胞免疫荧光： 通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察，检测ABPA1处理后，促凋亡蛋白Bax从胞浆向线粒体的转位情况，以及细胞色素c从线粒体向胞浆的释放情况。 * 线粒体形态与功能检测： * 透射电子显微镜（TEM）： 观察ABPA1处理2小时后，RKO和SW480细胞线粒体超微结构的改变。 * 线粒体膜电位检测： 使用TMRE荧光探针，通过荧光显微镜观察和流式细胞术定量，评估ABPA1处理对线粒体膜电位（ΔΨm）的影响，膜电位下降提示线粒体去极化。 * 三羧酸循环（TCA Cycle）中间产物检测： 采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，定量分析ABPA1处理不同时间（15， 30， 60分钟）后，RKO和SW480细胞中TCA循环关键中间代谢物（如柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等）的水平变化。 * 电子传递链（ETC）复合物活性测定： 使用商品化试剂盒，分别测定ABPA1处理2小时后，细胞中线粒体复合物I、II、III、IV的酶活性。 * ATP含量测定： 使用ATP检测试剂盒，测定ABPA1处理2小时后细胞内ATP的浓度。 * 活性氧（ROS）水平检测： 使用DCFH-DA荧光探针，通过流式细胞术和荧光显微镜，检测ABPA1处理2小时后细胞内ROS的水平。
3. 体内动物实验：ABPA1在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果评估 * 研究对象： 雄性C57BL/6小鼠（4-6周龄），建立原位结肠癌模型。 * 模型建立与给药方案： * 首先皮下接种表达荧光素酶（luciferase）的MC38细胞（MC38-luc），形成皮下瘤。 * 将皮下瘤组织切成小块，手术植入小鼠结肠内，建立原位移植瘤模型。 * 通过活体成像技术监测肿瘤荧光信号，当首次观察到信号后，将荷瘤小鼠随机分为对照组和ABPA1治疗组。 * ABPA1治疗组以100 mg/kg/天的剂量（根据前期安全评估实验及文献报道的多糖剂量范围确定）灌胃给药，每日一次，直至实验结束。对照组给予等体积溶剂。 * 疗效评估方法： * 肿瘤生长监测： 每5天通过活体成像系统定量分析小鼠体内的荧光信号强度，以评估肿瘤生长情况。 * 组织学分析： 实验结束后取肿瘤组织，进行： * 苏木精-伊红染色： 观察肿瘤组织的整体形态结构。 * 免疫组织化学： 检测肿瘤组织中Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平，以评估细胞凋亡情况。 * TUNEL检测： 通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术，在荧光显微镜下直接观察并定量肿瘤组织中的凋亡细胞。
4. 数据分析： 所有实验均独立重复三次，数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P < 0.05认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果
1. 多糖ABPA1的结构确证： 成功从AVBEC中分离纯化出一种均一的乙酰化甘露聚糖ABPA1。其分子量约为360 kDa，单糖组成以甘露糖为主（89.5%），主要糖苷键类型为β-1，4-连接的甘露糖，且骨架上存在大量随机分布的乙酰基。这为后续功能研究提供了明确的物质基础。
2. ABPA1在体外诱导结直肠癌细胞凋亡： 流式细胞术结果显示，ABPA1能以时间依赖性的方式显著诱导RKO和SW480细胞发生凋亡，且其促凋亡作用强于其粗提物AVBEC。Western Blot结果进一步证实，ABPA1处理能上调Cleaved Caspase-3（活化形式的Caspase-3）的表达，表明凋亡执行程序被激活。
3. ABPA1在体内抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡： 在原位结肠癌小鼠模型中，每日灌胃ABPA1（100 mg/kg）能显著减缓甚至缩小肿瘤的生长面积。治疗第10天，ABPA1组的肿瘤荧光信号强度显著低于对照组。组织学分析显示，ABPA1治疗组的肿瘤组织细胞排列更松散，边界更不清晰。同时，免疫组化和TUNEL检测均表明，ABPA1治疗组肿瘤组织中Cleaved Caspase-3阳性和TUNEL阳性细胞数量显著增加，证实了其在体内同样能有效诱导肿瘤细胞凋亡。
4. ABPA1引起线粒体形态和功能异常： TEM观察发现，ABPA1处理2小时后，两种癌细胞的线粒体均发生显著但形态各异的病变：RKO细胞的线粒体膜结构消失、嵴融合甚至消失；而SW480细胞的线粒体则出现肿胀甚至膜破裂。TMRE染色显示，ABPA1处理导致两种细胞的线粒体膜电位均显著下降，表明线粒体功能受损。
5. ABPA1通过线粒体途径诱导细胞凋亡： 免疫荧光结果显示，ABPA1处理能促使促凋亡蛋白Bax从胞浆转位至线粒体。同时，细胞色素c的免疫荧光信号从线粒体的网状分布变为点状弥散分布，表明其从线粒体释放到了细胞质中。Western Blot结果也验证了Bax表达的上调、细胞色素c的释放以及下游Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的激活。这一系列证据清晰地表明，ABPA1通过诱导线粒体外膜通透性改变，启动线粒体介导的内源性凋亡途径。
6. ABPA1干扰线粒体代谢： 这是本研究的核心发现之一。LC-MS分析显示，ABPA1对两种细胞TCA循环的影响不同：在RKO细胞中，多种TCA循环中间产物水平升高，提示循环可能被加速；而在SW480细胞中，多数中间产物受到抑制，提示TCA循环存在严重缺陷。ETC复合物活性测定结果也呈现细胞特异性：在RKO细胞中，复合物I和II的活性显著降低；而在SW480细胞中，复合物III的活性显著升高。尽管存在这些差异，但共同的结果是：ABPA1处理导致两种细胞的ATP产量均显著下降，同时细胞内ROS水平急剧升高。ATP的耗竭和ROS的爆发性增长共同推动了细胞走向凋亡。
五、 研究结论与意义
结论： 本研究首次从芦荟提取物AVBEC中分离纯化出均一的乙酰化甘露聚糖ABPA1，并系统阐明了其抗结直肠癌的作用机制。ABPA1能够直接诱导结直肠癌细胞发生凋亡，并在小鼠原位结肠癌模型中有效抑制肿瘤生长。其分子机制在于：ABPA1通过干扰肿瘤细胞的线粒体代谢（影响TCA循环和氧化磷酸化），导致线粒体形态和功能异常（膜电位丧失），进而诱导线粒体途径的凋亡——即促进Bax蛋白转位至线粒体，增加线粒体外膜通透性，释放细胞色素c，最终激活Caspase级联反应，导致细胞凋亡。
意义与价值： * 科学价值： 1. 揭示了植物多糖直接靶向肿瘤细胞的新机制： 突破了传统认为植物多糖主要通过免疫调节发挥抗肿瘤作用的认知，明确证明了ABPA1可直接作用于肿瘤细胞内部的线粒体，通过干扰能量代谢直接触发凋亡程序。 2. 阐明了代谢异质性在药物反应中的作用： 研究观察到ABPA1对RKO和SW480两种细胞线粒体代谢的影响模式不同，这反映了肿瘤细胞固有的代谢异质性。研究提示，即使存在这种异质性，针对线粒体这一核心细胞器，仍能找到导致其功能崩溃的共同弱点（如ATP耗竭和ROS累积），这为克服肿瘤异质性带来的治疗挑战提供了新思路。 3. 为“代谢疗法”提供了新的候选分子： 明确了ABPA1是一种线粒体代谢干扰剂，为开发靶向肿瘤细胞代谢重编程的抗癌药物提供了新的先导化合物和理论依据。 * 应用价值： ABPA1作为一种天然来源的多糖，具有低毒性的潜在优势。本研究为其开发成为一种靶向线粒体的新型抗结直肠癌药物或辅助治疗剂奠定了坚实的临床前研究基础。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容