本文发表于 *Nature Communications*，2020年，文章标题为“ATAC-seq footprinting unravels kinetics of transcription factor binding during zygotic genome activation”，主要作者包括 Mette Bentsen、Philipp Goymann、Hendrik Schultheis 等，通讯作者为 Mario Looso，研究单位包括马克斯·普朗克心肺研究所生物信息学核心单元（Bioinformatics Core Unit, Max Planck Institute for Heart and Lung Research）和德国心血管研究中心（DZHK）等。文章属于类型a，即单一原创研究。
该研究的学术背景是转录因子（transcription factor, TF）结合在转录调控和细胞状态转变中的核心作用。ATAC-seq（assay of transposase accessible chromatin）可以揭示染色质开放区域，但传统上鉴定特定转录因子结合位点主要依赖ChIP-seq。ChIP-seq需要大量细胞、每次只能检测一个转录因子，且受限于抗体可用性。数字基因组足迹（digital genomic footprinting, DGF）理论上可以从ATAC-seq数据中推断转录因子结合，但由于Tn5转座酶序列偏好、缺乏统一的生物信息学工具以及足迹比较困难，DGF在ATAC-seq数据上的广泛应用受到限制。本研究旨在开发一个全面的、准确的、快速的足迹分析框架TOBIAS（Transcription factor Occupancy prediction by Investigation of ATAC-seq Signal），并利用该框架研究人类和小鼠合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）过程中转录因子结合的动态变化。
研究的工作流程分为多个层次。首先，TOBIAS框架以ATAC-seq reads、转录因子motif和基因组注释为输入，核心步骤包括Tn5偏好校正（bias correction）、足迹评分（footprinting）以及条件间差异结合分析（differential binding）。Tn5偏好校正模块名为ATACorrect，利用二核苷酸权重矩阵（dinucleotide weight matrix, DWM）估计背景Tn5偏好，并计算期望切割信号，从原始信号中减去期望信号得到校正后的信号，从而突出蛋白结合导致的信号缺失。足迹评分模块结合了足迹深度（depletion）和染色质可及性（accessibility）来计算连续足迹分数，用于区分结合位点和未结合位点。差异结合模块可以对多个条件进行比较，并通过火山图展示全局转录因子结合变化。此外，TOBIAS还包含转录因子网络推断和足迹可视化等下游分析工具。
在验证方面，研究使用了217组成对的ChIP-seq/ATAC-seq数据集，涵盖GM12878、A549、HepG2和K562四种细胞类型。ChIP-seq峰被视为真实结合位点，用于评估足迹预测的准确性。结果显示TOBIAS在偏置校正和足迹识别方面优于现有工具HINT-ATAC、PIQ、Wellington，并与msCentipede整体表现相当。经过TOBIAS校正后，可测量的足迹比例从约20%提高到约59%至65%，说明Tn5偏好校正可以揭示被隐藏的真实足迹。
在合子基因组激活研究中，研究者分析了来自人类和小鼠植入前胚胎不同发育阶段（2细胞、4细胞、8细胞、内细胞团ICM以及胚胎干细胞ESC）的ATAC-seq数据，分别对590个人类和464个小鼠转录因子motif进行了足迹评分和聚类分析。人类数据中发现了10个具有特定结合模式的聚类，大多数转录因子活性在4细胞至8细胞阶段达到峰值，与ZGA的转录爆发一致。聚类1和2包含在2–4细胞阶段活性最高的转录因子，包括已知母源因子LHX8、BACH1、EBF1、LHX2等，以及ZGA早期调控因子DUX4和DUXA。聚类6则包含8细胞阶段特异性的转录因子，如PITX1、PITX3、SOX8、MEF2A、MEF2D、OTX2、PAX5和NKX3.2等。通过对DUX4、ZSCAN4、GATA2和CTCF的聚集足迹可视化，研究发现这些转录因子的足迹在预期发育阶段呈现出信号缺失，并且这些足迹只有在Tn5偏好校正后才能清晰可见。此外，TOBIAS预测的转录因子活性与RNA表达时序总体一致，但部分转录因子如SALL4的蛋白结合活性与其mRNA表达时序不一致，提示母源蛋白的存在。
研究还比较了人类和小鼠ZGA期间的转录因子结合差异。由于小鼠ZGA发生在2细胞阶段，人类ZGA发生在4–8细胞阶段，研究识别出30个在两个物种中均具有ZGA特异性的转录因子，包括OTX1、GSC、CPHX、HLTF和ARID3A等。在小鼠2细胞与4细胞的比较中，发现Obox家族转录因子在2细胞阶段活性较高，而TEAD和AP-2家族在4细胞阶段活性增加。在人类8细胞与ICM的比较中，PITX1-3、RHOXF1、CRX和DMBX1等homeobox转录因子在8细胞阶段活性较高，而POU5F1（OCT4）等多能性因子在ICM中活性增加。TOBIAS还通过转录因子结合位点重叠进行聚类，发现小鼠中RHOXF1 motif与Obox1/3/5和OTX2结合位点有约60%重叠，但在人类中RHOXF1与OTX2的motif重叠仅为约35%，提示RHOX和Obox转录因子在不同物种ZGA中可能具有功能对应关系。
进一步，研究聚焦于DUX转录因子。利用DUX过表达（DUXOE）的mESC ATAC-seq数据，TOBIAS预测DUX和Obox转录因子活性增加，而多能性因子NANOG、POU5F1和SOX2的结合显著下降。DUX足迹在DUXOE条件下清晰可见，并且TOBIAS能够将约30%的潜在结合位点判别为结合状态。将足迹变化与RNA表达变化关联后，发现足迹获得与基因表达上调显著相关。已知DUX靶基因如ZSCAN4C和PRAMEF25在DUXOE中显示局部足迹。TDPOZ1基因启动子区包含两个潜在DUX结合位点，TOBIAS预测其中一个被结合，另一个未结合，且TDPOZ1在DUXOE中表达显著上调。基于DUX的靶基因，TOBIAS网络模块推断出一个由DUX启动的转录因子激活级联，包含7个一级靶转录因子和32个二级转录因子。体内发育阶段RNA-seq数据验证了DUX在2细胞阶段的早期表达及其靶基因的时序激活。
此外，研究发现40%的DUX结合位点未注释到基因，其中64%位于长末端重复序列（long terminal repeat, LTR），28%位于LINE1元件。LTR和LINE1相关DUX结合位点在DUXOE和体内发育阶段均显示出转录活性，部分位点不与任何已知基因或重复元件重叠，但仍发生转录，提示可能存在新的由DUX调控的遗传元件。
研究的结论是TOBIAS是第一个能够完成DGF分析全流程的综合性软件框架，支持多条件比较和可视化。通过对人类和小鼠合子基因组激活的应用，TOBIAS揭示了大规模转录因子结合动态，发现DUX在ZGA中不仅激活级联转录因子网络，还结合重复元件并诱导新型遗传元件的表达。此外，TOBIAS能够将转录因子结合预测与RNA-seq整合，有助于区分激活因子和抑制因子，并揭示转录因子表达与蛋白结合活性之间的时间差异。
本研究的亮点包括：开发了TOBIAS这一创新性工具，显著提高了ATAC-seq足迹分析的准确性和通量；系统性地研究了人类和小鼠ZGA过程中的转录因子结合动态；揭示了DUX在ZGA中的调控网络及其对重复元件和新型遗传元件的影响；并展示了DGF方法在少量细胞样本（如早期胚胎）中大规模并行研究转录因子结合的潜力。研究也指出，足迹分析仍依赖于高质量的转录因子motif，且无法解析细胞异质性，但通过单细胞ATAC-seq的伪批量聚合，未来有望在单细胞水平实现足迹分析。总体而言，TOBIAS框架为表观遗传学研究提供了一种通用且高效的转录因子结合分析工具。