关于“CXCR6+ T细胞驱动免疫检查点抑制剂心肌炎”研究的学术报告
本研究的主要通讯作者为Amir Z. Munir博士与Javid J. Moslehi博士，其所属机构为加州大学旧金山分校（UCSF）医学院心脏肿瘤学与免疫学部门及心血管研究所。合作作者来自包括华盛顿大学圣路易斯分校、范德堡大学医学中心、巴黎皮提耶-萨尔佩特里尔医院、哈佛医学院在内的多个国际知名研究机构。这项原创性研究成果以“*CXCR6+ T cells drive immune checkpoint inhibitor myocarditis*”为题，发表于心血管领域顶级期刊《Circulation》，预印出版时间为2026年，卷期号为第153卷，文章DOI号为10.1161/CIRCULATIONAHA.125.076976。
研究的学术背景 本研究隶属于肿瘤心脏病学与免疫学的交叉领域，聚焦于免疫检查点抑制剂治疗引发的严重并发症——免疫检查点抑制剂相关心肌炎。免疫检查点抑制剂通过阻断T细胞表面的抑制性蛋白（如PD-1、CTLA-4、LAG-3等）来激活抗肿瘤免疫，彻底改变了多种癌症的治疗格局。然而，这类疗法，尤其是联合用药，可能引发针对健康组织的免疫攻击，即免疫相关不良事件。其中，ICI心肌炎虽然发生率相对较低（约1-2%），但死亡率极高，可达46%。目前的主要治疗手段糖皮质激素虽能非特异性抑制免疫，但疗效有限且副作用显著，因此临床上亟需针对性的新型疗法。
近年来，靶向LAG-3（淋巴细胞激活基因3）的抑制剂，如relatlimab，与抗PD-1药物（如nivolumab）的联合疗法因其抗肿瘤疗效而获批用于晚期黑色素瘤。然而，关键的临床试验数据显示，抗LAG-3/PD-1联合治疗将心肌炎的风险提高了近3倍。鉴于目前有超过15种不同的抗LAG-3抗体在超过100项临床试验中进行测试，深入理解LAG-3相关心肌炎的发病机制迫在眉睫。尽管先前研究已证实致病性T细胞是ICI心肌炎的必要条件，并在其他模型中揭示了CXCL9/10-CXCR3轴等招募机制，但在抗LAG-3/PD-1治疗背景下，驱动心脏T细胞浸润和扩张的具体信号通路及T细胞亚群仍未完全阐明。本研究旨在：1） 通过药物警戒数据库确认抗LAG-3疗法增加心肌炎风险的临床观察；2） 建立并表征模拟抗LAG-3/PD-1联合治疗的心肌炎小鼠模型；3） 深入解析该模型中心脏免疫细胞的组成与特征；4） 识别关键的致病性T细胞群体并验证其治疗靶点潜力。
详细的研究流程 本研究设计缜密，逻辑链条清晰，主要包含以下几个核心步骤： 1. 临床风险确认与模型构建：首先，研究团队利用世界卫生组织旗下的国际药物警戒数据库VigiBase（数据截至2024年1月），对抗LAG-3联合疗法与心肌炎风险的关联进行了回顾性分析。研究筛选了超过13万例与抗PD-1治疗相关的不良反应报告，并通过多变量逻辑回归模型，比较了接受抗LAG-3/PD-1联合治疗与仅接受抗PD-1单药治疗的患者发生心肌炎（及其他肌毒性事件）的风险比。在动物模型方面，研究者通过基因工程手段，将Lag3基因敲除小鼠与Pdcd1（编码PD-1蛋白）基因敲除小鼠杂交，获得了双基因敲除小鼠（Lag3-/-， Pdcd1-/-）。该模型旨在模拟同时阻断LAG-3和PD-1通路的治疗效果。研究对小鼠进行了全面的表型分析，包括生存期监测、多器官（心、肺、肝、胰、肾、胃）组织病理学检查（H&E染色并由病理学家盲法评分）、血浆生化及心肌肌钙蛋白I（cTnI）检测、心电图连续监测以及心脏超声评估左心室功能。 2. 模型免疫表型深度解析：为阐明Lag3-/-， Pdcd1-/-小鼠心脏炎症的免疫学基础，研究进行了多层次的免疫细胞分析。通过流式细胞术定量分析了心脏浸润免疫细胞中T细胞（CD3+）的比例和绝对数量，并初步评估了CD4+与CD8+ T细胞的亚群分布。更为关键的是，研究团队对从6周龄小鼠心脏中分选出的CD45+免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），并同时进行了T细胞受体（TCR）测序。这是一个技术亮点，它允许在单细胞分辨率下同时分析细胞的转录组和克隆性。样本处理上，将来自4只心肌炎小鼠的心脏免疫细胞与来自6只野生型（WT）小鼠的细胞分别汇池后进行测序。数据分析使用10x Genomics平台和Seurat等R语言软件包，对细胞进行聚类、注释，并识别各细胞簇的特征基因。通过TCR序列分析，确定了克隆性T细胞（即共享相同TCR序列的T细胞群）的比例和扩增程度。 3. 关键靶点识别与验证：通过对scRNA-seq数据的深入挖掘，研究识别出在模型小鼠心脏T细胞中特异性高表达的基因。进一步，为了验证这一发现的普适性，研究者分析了已发表的Pdcd1-/-单敲除小鼠和Ctla4+/-， Pdcd1-/-双敲除小鼠心脏的scRNA-seq公共数据集，并分析了15例接受不同ICI方案治疗的心肌炎患者和6例健康供者心脏的scRNA-seq数据，以确认该靶点在人类疾病中的表达情况。同时，通过流式细胞术检测了模型小鼠心脏、胰腺、肝脏和血液中表达该靶点的T细胞比例，以评估其组织特异性。此外，研究还通过scRNA-seq和流式细胞术分析了心脏巨噬细胞/单核细胞群体，寻找与T细胞靶点相对应的配体表达情况。为了验证配体-受体相互作用的直接功能，研究从小鼠心脏和外周血中分选出T细胞，进行了体外趋化实验，测试重组配体蛋白对心脏T细胞的化学吸引能力。 4. 靶向性功能干预实验：为了证明所识别的T细胞亚群在疾病发生中的必要性（而不仅仅是相关性），研究设计了抗体介导的细胞清除/功能阻断实验。将21日龄的Lag3-/-， Pdcd1-/-小鼠随机分组，分别接受抗靶点抗体、抗CXCR3抗体（作为已知相关通路的对照）或同型对照抗体（IgG1）处理，腹腔注射，每周两次，持续至实验终点（70日龄）。研究监测了各组小鼠的生存率、每周心电图变化（评估心律失常发生率），并在终点时获取心脏组织进行病理学炎症面积定量和流式细胞术分析，以评估抗体治疗对炎症细胞浸润的影响。此外，为了验证该治疗策略在其他模型中的效果，研究也在Ctla4+/-， Pdcd1-/-小鼠模型中进行了短期的抗靶点抗体干预，并通过流式细胞术分析了其对心脏T细胞亚群的影响。
主要研究结果 1. 临床与模型表型确认：药物警戒分析显示，与仅使用抗PD-1治疗相比，抗LAG-3/PD-1联合治疗使心肌炎的报告风险显著增加（调整后比值比[OR]为4.0），且其风险高于抗CTLA-4/PD-1联合方案（OR=1.7）。在动物模型中，Lag3-/-， Pdcd1-/-小鼠表现出严重的早发性致死，多数在8-10周内死亡，而Pdcd1-/-单敲除小鼠生存正常。组织病理学显示，双敲除小鼠的炎症主要集中于心脏，其他器官炎症不明显。血浆cTnI水平在双敲除小鼠中急剧升高，证实了显著的心脏损伤。心电图监测发现双敲除小鼠随年龄增长出现进行性加重的心律失常，包括房室传导阻滞和室性心律失常，这是导致其过早死亡的重要原因，而心脏超声显示其左心室射血分数并未下降，这与部分人类ICI心肌炎表型一致。 2. 免疫特征揭示与关键靶点发现：流式细胞术证实Lag3-/-， Pdcd1-/-小鼠心脏中T细胞比例和绝对数量均显著增加，且以CD8+ T细胞为主。scRNA-seq将心脏免疫细胞分为7个主要簇，其中“活化T细胞”、“增殖T细胞”和“巨噬细胞/单核细胞”在模型鼠中显著富集。活化T细胞高表达细胞毒性分子（如NKG7、CCL5）、共刺激分子（ICOS）及耗竭标记（CTLA4， TIGIT）。TCR测序显示模型鼠心脏中高达41%的T细胞是克隆性的，并存在明显的克隆扩增（>20%的T细胞属于超过10个细胞的大克隆）。对scRNA-seq数据的深入分析发现，C-X-C基序趋化因子受体6（CXCR6）是模型鼠心脏活化T细胞的一个关键标志物。这一发现在Pdcd1-/-和Ctla4+/-， Pdcd1-/-小鼠的公共数据集中得到验证。更重要的是，在人类ICI心肌炎患者的心脏scRNA-seq数据中，CXCR6的表达也显著高于健康对照。流式细胞术进一步证实，CXCR6+ T细胞在模型鼠心脏中特异性富集，而在其胰腺、肝脏和血液中则无此现象。 3. 配体-受体轴功能阐释：对scRNA-seq中巨噬细胞/单核细胞亚群的重聚类分析发现了一个特异性高表达CXCL16（C-X-C基序趋化因子配体16）的心脏巨噬细胞亚群。CXCL16是CXCR6唯一已知的配体。模型鼠心脏中CXCL16的表达（RNA和蛋白水平）均显著上调。体外趋化实验证明，从模型鼠心脏分离的T细胞能够被重组CXCL16蛋白显著趋化，而血液T细胞则无此反应，这支持了CXCL16-CXCR6轴在介导心脏T细胞定位中的特异性作用。 4. 靶向干预验证必要性：抗CXCR6抗体治疗取得了突破性效果。与全部死亡的同型对照组相比，接受抗CXCR6治疗的所有Lag3-/-， Pdcd1-/-小鼠均存活至实验终点（70天）。治疗显著减轻了心脏的组织病理学炎症面积，几乎完全消除了心律失常的发生。流式细胞术显示治疗组心脏中总T细胞和CXCR6+ T细胞的比例均显著下降。作为对照，抗CXCR3抗体治疗虽然也延长了生存期并减少了炎症面积，但部分小鼠（4/8）仍发生了心律失常，提示两种趋化因子受体在疾病中的作用可能存在差异。此外，在Ctla4+/-， Pdcd1-/-模型中，短期抗CXCR6治疗也特异性减少了心脏中CD8+效应记忆T细胞的数量。
研究的结论与意义 本研究得出结论：ICI心肌炎，特别是与抗LAG-3/PD-1联合治疗相关的心肌炎，是由心脏中CXCR6+ T细胞的扩增所驱动的。CXCR6标记了一群异质性的心脏T细胞，包括表达不同颗粒酶亚型、CD4+及增殖中的T细胞。其配体CXCL16在心脏巨噬细胞中特异性上调，共同构成了介导T细胞心脏定位与活化的关键信号轴。最重要的是，靶向清除CXCR6+ T细胞能够有效预防心肌炎的发生发展，挽救小鼠生命，这证明CXCR6+ T细胞是疾病发生所必需的。
本研究具有重要的科学价值与应用前景。科学上，它首次建立了模拟抗LAG-3/PD-1联合治疗心肌炎的遗传学小鼠模型，为研究此类高风险的ICI不良反应提供了强有力的工具。研究通过整合临床数据、多模型验证和单细胞多组学技术，系统地揭示了CXCR6-CXCL16轴在驱动心脏特异性T细胞炎症中的核心作用，深化了对ICI心肌炎分子机制的理解，特别是补充了LAG-3相关心肌炎领域的认知空白。应用上，研究首次提出并验证了CXCR6作为一个潜在的治疗靶点。由于CXCR6-CXCL16是单配体-单受体的配对，靶向干预可能更具特异性。与广泛免疫抑制的糖皮质激素相比，抗CXCR6疗法有望实现更精准的免疫调节，在抑制心肌炎的同时，可能对全身抗肿瘤免疫的影响更小，为开发针对这一高死亡率并发症的新型疗法提供了坚实的临床前依据和明确的药物作用靶点。
研究亮点 1. 新颖且具临床相关性的模型：成功构建并详细表征了Lag3-/-， Pdcd1-/-双敲除小鼠模型，该模型100%自发发生严重、致死性心肌炎，完美模拟了临床高危的联合治疗场景，且表型稳定，优于部分药物诱导模型。 2. 关键技术整合与深度解析：研究娴熟结合了药物流行病学、动物模型、单细胞转录组与TCR测序、流式细胞术、功能抗体干预等多层次技术，从人群风险、整体表型、细胞图谱、克隆特性、分子机制到治疗验证，形成了完整而坚实的证据链。 3. 关键致病机制的发现：首次将CXCR6+ T细胞确立为驱动ICI心肌炎，尤其是LAG-3/PD-1相关心肌炎的核心效应细胞，并阐明了其与CXCL16+心脏巨噬细胞的相互作用轴。 4. 治疗靶点的概念验证：研究不仅停留在机制探讨，更通过抗体治疗实验，直接证明了靶向CXCR6在预防和治疗小鼠心肌炎中的显著疗效，完成了从“发现”到“验证”的转化研究关键步骤，具有明确的临床转化潜力。 5. 跨物种与跨模型验证：研究结果在小鼠遗传模型、小鼠其他ICI模型以及人类患者样本中均得到一致验证，极大地增强了研究结论的可靠性和普适性。
其他有价值的内容 研究也提出了一些值得未来深入探讨的科学问题。例如，与CXCR3主要参与外周T细胞招募不同，CXCR6可能更多地与心脏内T细胞的定位、存活（通过可能的IL-15反式呈递）及组织驻留记忆表型的建立相关。此外，为何抗LAG-3疗法会特别加剧心肌炎风险？这可能与LAG-3在CD4+ T细胞上的特异性功能有关，但具体机制仍需阐明。研究中观察到的严重缓慢性心律失常（房室传导阻滞）的机制，以及心脏炎症与心律失常的直接联系，也是未来极具价值的研究方向。最后，研究也谨慎地指出，需要在同时携带肿瘤的模型中进行抗CXCR6治疗实验，以评估其对肿瘤免疫疗效的潜在影响，这是该疗法走向临床前必须回答的关键问题。