作者： Li-ling Chen, Rui-feng Huang, Jin-ting Lin, Lin Yang, Yu-dan Zhang, Xin-hui You, Li-ping Lin
机构： 福建省医疗器械与医药技术重点实验室（福建医科大学），福建医科大学医学技术与工程学院
发表期刊： 《Analytical Chemistry》
发表日期： 2020年
本项研究属于分析化学与生物医学工程交叉领域，具体聚焦于神经退行性疾病生物标志物的超灵敏检测技术。研究的核心目标是开发一种新型荧光免疫测定方法，用于检测阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的关键生物标志物——Tau蛋白。
研究背景与动因： 阿尔茨海默病是痴呆症的最主要成因，其早期、精准诊断对于疾病干预和延缓进展至关重要。Tau蛋白作为一种微管相关蛋白，在AD患者脑脊液和血液中会发生异常磷酸化并形成神经纤维缠结，其浓度变化与疾病进程密切相关。因此，Tau蛋白被公认为AD的核心生物标志物之一。然而，血液中Tau蛋白浓度极低（通常在pM至fM水平），对检测技术的灵敏度、特异性提出了极高要求。传统的检测方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）虽广泛应用，但其灵敏度往往难以满足超早期诊断的需求；而基于聚合酶链式反应（PCR）的信号放大方法虽然灵敏，但操作复杂、成本高昂且可能存在交叉污染风险。
因此，研究团队旨在开发一种无需复杂信号放大系统、操作简便、且具备超高灵敏度的新型检测平台。他们创新性地将量子点荧光技术与酶促氧化还原反应相结合，构建了一种“氧化还原介导的荧光免疫测定”新策略。该策略的核心思想是利用酪氨酸酶（Tyrosinase, Tyr）催化量子点表面修饰的底物（多巴胺, Dopamine, DA）发生氧化，导致量子点荧光猝灭，从而将Tau蛋白的浓度信号转化为可定量测量的荧光强度变化信号。
研究目标： 1. 合成并表征高发光、低毒性的水溶性CuInS₂/ZnS核/壳量子点（CuInS₂/ZnS QDs），并对其表面进行多巴胺功能化修饰，制备CuInS₂/ZnS-DA探针。 2. 构建用于捕获和检测Tau蛋白的夹心型免疫识别结构（Tau适体-Tau蛋白-抗Tau抗体）。 3. 优化酪氨酸酶与抗Tau抗体的偶联工艺及整个检测体系的反应条件（如浓度、温度、时间等）。 4. 系统评估所构建检测方法对Tau蛋白的分析性能，包括灵敏度、线性范围、特异性，并验证其在实际人血清样本中的适用性（加标回收实验）。 5. 阐明该氧化还原介导的荧光猝灭机理，并展示该方法在AD生物标志物检测中的应用潜力。
本研究包含一系列逻辑严密、循序渐进的实验步骤，主要可分为以下几个核心环节：
（一） 荧光探针CuInS₂/ZnS-DA的制备与表征 * 研究对象与样本： 采用水热法自行合成的CuInS₂/ZnS核/壳量子点。 * 处理与实验： 1. 量子点合成： 首先，研究团队通过高温热注射法成功制备了CuInS₂核量子点，随后在其表面外延生长ZnS壳层，形成CuInS₂/ZnS核/壳结构。该结构能有效钝化核表面缺陷，显著提高量子点的荧光量子产率和光稳定性，并降低重金属离子的生物毒性。 2. 表面功能化： 利用量子点表面的羧基与多巴胺分子中的氨基之间的酰胺化反应，将多巴胺共价偶联到量子点表面，成功制备了CuInS₂/ZnS-DA复合探针。多巴胺在此扮演双重角色：既是酪氨酸酶的底物，也是电子受体。 3. 表征分析： 通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等手段，系统地表征了量子点及其功能化产物的形貌、尺寸、晶体结构、表面化学组成以及光学性质，确认了CuInS₂/ZnS-DA的成功制备。
（二） 检测原理验证与条件优化 * 研究对象： CuInS₂/ZnS-DA探针与酪氨酸酶（Tyr）的 reaction system。 * 处理与实验： 1. 原理验证实验： 将酪氨酸酶加入到CuInS₂/ZnS-DA探针溶液中，观察荧光光谱的变化。同时，设置对照组（仅有量子点、仅有DA、量子点+DA等）。通过比较荧光强度、荧光寿命和量子产率的变化，证实酪氨酸酶能催化DA氧化为多巴胺醌（Dopaminequinone），后者作为高效的电子受体，通过光诱导电子转移（PET）或荧光共振能量转移（FRET）机制猝灭量子点的荧光。 2. 条件优化实验： 这是本研究的核心优化环节。 * DA修饰浓度优化： 测试了不同DA浓度（0-500 μM）功能化后探针的荧光强度，以及加入固定量Tyr后的荧光猝灭效率。结果显示，当DA浓度为400 μM时，体系的荧光猝灭效果最佳，因此选定400 μM为最优条件。 * Tyr浓度优化： 固定DA浓度，考察不同浓度Tyr（10 pM 至 100 nM）对荧光猝灭的影响，确定了产生显著信号变化所需的Tyr浓度范围。 * 反应时间与温度优化： 监测了37°C和室温下，荧光强度随时间（0-30分钟）的变化。发现37°C下反应5分钟内荧光猝灭即达到平台期，因此选择37°C、反应5分钟作为最佳检测条件。 * 夹心结构比例优化： 为后续免疫测定准备，优化了96孔板包被的Tau适体浓度、作为捕获分子和检测分子桥连的Tau蛋白与酪氨酸酶-抗Tau抗体偶联物（Tyr-anti-Tau） 的最佳摩尔比。通过棋盘滴定法，确定Tau适体最佳包被浓度为1 μM，Tau蛋白与Tyr-anti-Tau的最佳反应比例为1:1。
（三） 氧化还原介导的荧光免疫测定法的构建与性能评估 * 研究对象： 模拟实际检测的体系，使用96孔板作为固相载体。 * 处理与实验流程： 1. 夹心结构组装： 在96孔板中依次进行以下操作： a. 包被： 将优化浓度（1 μM）的Tau DNA适体溶液加入孔中，4°C孵育过夜，使适体通过生物素-链霉亲和素作用固定在孔板上，随后用牛血清白蛋白（BSA）溶液封闭非特异性位点。 b. 捕获： 加入不同浓度的Tau蛋白标准品溶液（或待测样本），孵育，使Tau蛋白被 plate上的适体特异性捕获。 c. 检测： 加入酪氨酸酶-抗Tau抗体偶联物（Tyr-anti-Tau），孵育，形成“Tau适体 - Tau蛋白 - 抗Tau抗体”的完整夹心结构。 d. 信号产生： 最后加入制备好的CuInS₂/ZnS-DA探针溶液，在37°C下反应5分钟。Tyr-anti-Tau中的酪氨酸酶催化其附近的DA氧化，导致该孔中量子点荧光猝灭。 2. 信号读取： 使用荧光酶标仪测量各孔在特定激发/发射波长下的荧光强度。荧光猝灭的程度与孔中结合的Tyr-anti-Tau量成正比，而后者又与捕获的Tau蛋白浓度成正比，从而实现定量检测。 * 性能评估实验： 1. 灵敏度与线性范围： 将一系列浓度梯度（10 pM 到 200 nM）的Tau蛋白标准品代入上述流程进行检测。以Tau蛋白浓度的对数为横坐标，对应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 特异性验证： 为了考察该方法的选择性，选取了可能与Tau蛋白共存的两种其他蛋白——β淀粉样蛋白（Aβ）（AD另一标志物）和甲胎蛋白（AFP）（肝癌标志物）作为干扰物，在相同条件下进行检测，比较其荧光信号与Tau蛋白信号的差异。 3. 实际样本分析（加标回收实验）： 为了验证该方法在实际复杂生物样本中的适用性，使用健康人血清作为基质。在血清样本中分别加入低、中、高三个已知浓度的Tau蛋白，然后进行检测。根据标准曲线计算回收浓度，并与加入的已知浓度比较，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。同时，使用商品化ELISA试剂盒进行平行验证，以佐证本方法的可靠性。
（四） 数据统计分析 研究中对所有实验均设置了平行重复（通常n≥3）。数据以均值±标准差表示。采用线性回归分析拟合标准曲线并计算检出限（LOD，通常以3倍空白信号的标准偏差对应浓度或根据空白均值代入回归方程计算）。加标回收实验计算平均回收率和RSD。特异性实验通过直接比较信号强度进行定性分析。
（一） 探针制备与原理验证结果 * 成功合成了尺寸均一、分散性良好的CuInS₂/ZnS核/壳量子点，其荧光发射峰位于近红外区（~800 nm），量子产率高，生物相容性佳。 * FT-IR和XPS谱图证实多巴胺通过酰胺键成功连接至量子点表面。荧光光谱显示，CuInS₂/ZnS-DA探针的荧光强度随DA修饰量增加而逐渐降低（自猝灭），在400 μM时达到一个平衡点。 * 关键验证结果：当向CuInS₂/ZnS-DA探针中加入酪氨酸酶后，其荧光强度在5分钟内迅速且显著地降低，而对照组（无Tyr或无用DA功能化的量子点）荧光几乎不变。荧光寿命测试显示，加入Tyr后探针的平均荧光寿命大幅缩短，量子产率降至纯量子点的约10%。这些数据确凿地证明了：酪氨酸酶有效催化了量子点表面的多巴胺氧化为多巴胺醌，后者作为电子受体猝灭了量子点的荧光。这为整个检测方法奠定了坚实的原理基础。
（二） 条件优化结果 * DA最佳浓度：400 μM。在此浓度下，探针自身荧光适中，且在加入Tyr后能产生最大的荧光强度变化（即信噪比最佳）。 * Tyr有效工作浓度：在nM级别即可引|起显著荧光响应。 * 最佳反应条件：37°C， pH 6.5，反应时间5分钟。此条件下酶活高、反应迅速且 signal 稳定。 * 夹心结构最佳比例：Tau适体包被浓度1 μM时捕获效率高；Tau蛋白与Tyr-anti-Tau以1:1摩尔比反应时，荧光猝灭信号达到饱和，表明夹心结构组装完全。
（三） 检测性能评估结果 * 灵敏度与线性：该方法对Tau蛋白的检测展现出卓越的灵敏度。在10 pM 到 200 nM的浓度范围内，荧光强度与Tau蛋白浓度的对数呈现良好的线性关系，线性回归方程相关系数（R²）达0.998。方法检出限（LOD）低至9.3 pM，这达到了飞摩尔每升级（fM） 的检测水平。 * 特异性：如图8所示，在相同实验条件下，即使高浓度的Aβ（100 nM）和AFP（100 nM）存在，其引起的荧光变化微乎其微；而低浓度的Tau蛋白（10 pM）即能引起强烈的荧光猝灭。这充分证明了该方法对Tau蛋白具有高度特异性，不易受其他类似蛋白的干扰。 * 实际样本分析：在健康人血清中的加标回收实验结果令人满意（见表1）。三个浓度水平的平均回收率为101.00%，单个回收率在97.29%至104.38%之间，RSD均小于5.3%。该结果与商品化ELISA试剂盒的验证结果具有一致性，有力地证明了本方法具备检测实际复杂生物样本中痕量Tau蛋白的能力，可靠性高。
结论： 本研究成功开发并验证了一种基于铜铟硫量子点-多巴胺探针和酪氨酸酶诱导氧化还原反应的新型荧光免疫测定法，用于超灵敏检测阿尔茨海默病生物标志物Tau蛋白。该方法通过巧妙地偶联酶促反应与荧光信号输出，实现了对fM级别Tau蛋白的特异性、定量检测。整个方法无需复杂的核酸扩增或信号放大步骤，操作相对简便。
价值与意义： 1. 科学价值： * 方法学创新：首次报道了将酪氨酸酶催化的氧化还原反应应用于Tau蛋白的荧光检测，为氧化还原介导的生物传感领域提供了新思路和新范例。 * 机理明确：深入探究并证实了多巴胺醌作为电子受体猝灭量子点荧光的机理，丰富了基于量子点的荧光传感理论。 * 材料应用拓展：展示了CuInS₂/ZnS这类低毒、近红外发射量子点在超高灵敏度生物检测中的优异性能和巨大潜力。 2. 应用价值： * 疾病诊断：所建立的方法灵敏度极高（LOD=9.3 pM），超越了常规荧光免疫分析和表面等离子体共振（SPR）等方法，甚至优于部分需要PCR readout的夹心ELISA，为阿尔茨海默病的超早期筛查和诊断提供了一个强有力的潜在工具。 * 临床转化前景：加标回收实验证明了该方法在真实血清样本中的适用性，为其未来的临床应用转化奠定了基础。 * 平台普适性：该检测策略具有通用性，通过更换不同的适体或抗体，理论上可用于检测其他具有重要临床意义的疾病标志物，如癌症标志物、心肌标志物等，显示出广阔的平台化应用前景。
研究团队在论文中也提及了该方法的潜在局限性或未来展望，例如：如何进一步简化操作步骤以实现更快速的检测；如何将该方法与微流控芯片等技术集成，开发成便携式设备用于床旁检测（POCT）；以及探索该方法在其他神经退行性疾病或癌症标志物检测中的应用可能性。这些思考为后续研究指明了方向。