关于KRAS突变驱动的CLDN18.2 O-GlcNAc化促进胰腺癌进展并降低靶向治疗疗效的研究报告
本研究由刘静、侯旭鹏、李林、白伟伟、周天星、陈默然、于虎、孙红霞、徐婷婷、王一飞、常安涛、冯宇宽、余军、黄崇标、谢永杰与郝继辉（通讯作者）共同完成，作者单位主要来自天津医科大学肿瘤医院等机构。该项原创性研究发表于国际知名期刊 Gut 上，已于2025年11月在线发表，并计划于2026年正式出版（doi: 10.1136/gutjnl-2025-336277）。
一、 学术背景 胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC）是一种致死率极高的恶性肿瘤，治疗选择非常有限。紧密连接蛋白18.2（Claudin 18.2, CLDN18.2）因其在胃癌（GC）和胃食管结合部癌（GEJC）中的肿瘤特异性过表达和膜定位特性，已成为一个有前景的药物治疗靶点，相关靶向疗法已展现出显著疗效。然而，CLDN18.2靶向疗法在PDAC中的临床效果相对有限，这表明可能存在某种调控机制损害了其疗效。与此同时，KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）突变是PDAC的一个分子标志，在PDAC中极为常见，但在GC和GEJC中发生率较低。前期研究表明，KRAS突变能增强癌细胞的葡萄糖摄取，进而激活己糖胺生物合成途径（Hexosamine Biosynthesis Pathway, HBP），导致细胞内O-连接N-乙酰葡糖胺糖基化（O-linked N-acetylglucosaminylation, O-GlcNAcylation）水平升高。这种翻译后修饰对蛋白质的活性和定位至关重要。例如，E-钙黏蛋白的O-GlcNAc化会阻碍其正确运输至细胞表面，从而损害细胞粘附。
基于此背景，本研究旨在探讨以下几个核心问题：在PDAC中，CLDN18.2的亚细胞定位（膜定位 vs. 胞浆定位）与患者预后及治疗反应有何关联？其定位异常的分子机制是什么，特别是KRAS突变和O-GlcNAc修饰在其中扮演何种角色？这种修饰如何影响CLDN18.2的功能并促进肿瘤进展？更重要的是，能否找到一种策略来逆转这种不利修饰，从而恢复或增强CLDN18.2靶向疗法的敏感性？
二、 详细研究流程 本研究采用了多层次、多模型的系统性研究策略，流程严谨而复杂，主要包含以下几个关键部分：
1. 临床样本分析与预后关联确立： * 研究对象与样本量： 研究回顾性分析了来自天津医科大学肿瘤医院的106例接受R0切除的PDAC患者的肿瘤样本（2016年7月至2018年1月），构成主要队列。此外，还设立了一个包含100例患者的独立验证队列（2018年6月至2021年6月），以及一个包含40对匹配的原发灶和同步肝转移灶的PDAC患者队列。 * 实验与方法： * 免疫组织化学（IHC）分析： 使用EPR19202抗体对肿瘤组织进行CLDN18.2染色。由三位资深病理学家独立评估染色结果，区分膜表达（mem-CLDN18.2）和胞浆表达（cyto-CLDN18.2）。同时，研究团队开发了一套基于Cellpose算法结合机器学习的方法，实现了对细胞膜区域（定义为细胞边界2微米宽的条带）和胞浆区域（细胞内部除细胞核外部分）的自动化分割与评分，相关代码已在GitHub公开。这种自动化分析结果与病理学家评估结果高度一致。 * 多重免疫荧光（mIHC）分析： 为了更精确地定量，使用mIHC同时标记CLDN18.2（绿色）、膜标志物ATP1A1（红色）和细胞核DAPI（蓝色）。膜定位的CLDN18.2定义为与ATP1A1共定位的信号（显示为黄色），而胞浆CLDN18.2则为不与ATP1A1共定位的绿色信号。通过平均荧光强度（MFI）进行定量。 * 生存分析与统计学： 使用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型，分析cyto-CLDN18.2和mem-CLDN18.2表达水平与患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的关系。 * 数据与结果分析： 分析显示，CLDN18.2在肿瘤组织中高表达，且存在明显的膜和胞浆两种定位模式。胞浆表达在66.04%的病例中被检测到。多因素分析证实，高水平的cyto-CLDN18.2是OS和RFS的独立负性预后因素，而mem-CLDN18.2则无显著预后价值。这一发现在独立验证队列中得到了证实。此外，配对分析显示，与原发性PDAC相比，肝转移灶中的cyto-CLDN18.2水平显著上调。高cyto-CLDN18.2水平与更具侵袭性的临床病理特征（如更大的肿瘤体积、淋巴结转移、高肿瘤出芽）以及较高的空腹血糖和循环肿瘤细胞（CTC）计数相关。
2. 构建模型验证定位对治疗反应的影响： * 研究对象： 建立了6个人源化患者来源异种移植（humanized PDX, hPDX）小鼠模型，这些模型来源于手术切除的PDAC标本，并根据自动化评分分为膜主导型（cyto/mem评分<1, PDX#1-3）和胞浆主导型（cyto/mem评分>1, PDX#4-6）。 * 实验与方法： 在这些hPDX模型中给予抗CLDN18.2单克隆抗体（mAb）治疗，评估肿瘤生长抑制率。 * 数据与结果分析： 结果显示，抗CLDN18.2治疗在膜主导型模型中达到了66.33±8.10%的肿瘤生长抑制，而在胞浆主导型模型中仅为22.99±12.73%，差异极显著。在一项回顾性临床数据分析中，所有3名对CLDN18.2靶向治疗有反应的患者（100%）均表现为膜主导型CLDN18.2表达，而9名无反应者中有7名（77.8%）为胞浆主导型表达。这些结果强有力地表明，CLDN18.2的胞浆定位与其靶向治疗耐药密切相关。
3. 探索CLDN18.2胞浆定位的分子机制： * 研究对象： 选取了5例膜主导型和6例胞浆主导型（总CLDN18.2表达中高水平）的PDAC组织进行代谢组学和转录组学测序分析。同时，利用本中心（HRA000433）及公共数据库（CRA001160）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行分析。 * 实验与方法： * 组学分析： 通过代谢组学和转录组学比较两组间的代谢物和信号通路差异。 * 功能模型验证： * 患者来源类器官（PDO）模型： 使用KRAS G12D突变型和野生型（WT）的PDO，在高血糖（通过小鼠模型或培养基高糖处理）条件下，检测CLDN18.2的亚细胞分布变化。 * 分子互作检测： 使用免疫共沉淀（Co-IP）技术检测CLDN18.2与紧密连接蛋白ZO1的相互作用，以及O-GlcNAc修饰水平。 * 药理学干预： 使用O-GlcNAc转移酶（OGT）抑制剂OSMI-1来抑制O-GlcNAc化，或使用O-GlcNAc酶（OGA）抑制剂TMG来增强O-GlcNAc化，观察对CLDN18.2定位和ZO1结合的影响。 * 遗传学干预： 在KRAS WT的PDO中外源性表达KRAS G12D，或在KRAS G12D的PDO中使用KRAS G12D抑制剂MRTX1133，观察对CLDN18.2修饰和定位的影响。 * 数据与结果分析： 组学分析显示，胞浆主导型病例中HBP通路和O-连接糖基化相关基因显著富集。scRNA-seq鉴定出一个同时高表达CLDN18.2和糖基化相关基因的独特肿瘤细胞亚群。在PDO和小鼠模型中，高血糖条件显著增加了KRAS突变肿瘤中CLDN18.2的胞浆积累，同时减少了其膜定位，并升高了HBP终产物UDP-GlcNAc的水平。药理学和遗传学实验证明，抑制O-GlcNAc化（用OSMI-1或MRTX1133）可以增强CLDN18.2与ZO1的结合，促进其膜定位；而增强O-GlcNAc化（用TMG或激活KRAS）则起到相反作用。这表明KRAS突变和高血糖通过驱动CLDN18.2的O-GlcNAc化，破坏了其与ZO1的结合，导致其在胞浆中积累。
4. 鉴定O-GlcNAc化修饰位点及其功能验证： * 研究对象： 使用SW1990胰腺癌细胞系及构建的CLDN18.2敲除（KO）细胞系。 * 实验与方法： * 位点鉴定： 通过免疫沉淀结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，鉴定CLDN18.2蛋白上的潜在O-GlcNAc化位点。 * 位点突变体构建与功能验证： 构建了CLDN18.2野生型（WT）及S52A、S57A、T204A位点突变体的Flag标签表达载体，转染至CLDN18.2 KO细胞中。通过Co-IP检测各突变体的O-GlcNAc化水平及与ZO1的结合能力；通过细胞分馏和免疫荧光观察其亚细胞定位；通过伤口愈合、Transwell迁移、细胞运动轨迹追踪、侵袭伪足形成及明胶降解实验评估其促转移能力；在PDO与外周血单核细胞（PBMC）共培养体系中，评估其对CLDN18.2 mAb治疗敏感性的影响。 * 体内验证： 建立SW1990 CLDN18.2 KO细胞分别 reconstituted 空载体、WT CLDN18.2或T204A突变体的原位移植瘤小鼠模型，并联合使用OSMI-1，评估肿瘤生长、肝转移情况。 * 数据与结果分析： 质谱分析鉴定出S52、S57和T204为潜在修饰位点。功能实验证实，T204A突变能显著降低CLDN18.2的O-GlcNAc化，并增强其与ZO1的结合，促进膜定位，而S52A和S57A突变则无此效果。在体外功能实验中，WT CLDN18.2显著促进细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT），而T204A突变体则丧失了这些促癌功能。在PDO模型中，T204A突变体对CLDN18.2 mAb治疗的敏感性也显著高于WT。体内实验进一步证实，WT CLDN18.2促进肿瘤生长和肝转移，而T204A突变体无此作用，且OSMI-1处理可以完全消除WT CLDN18.2的促癌表型。这些结果确立了T204是CLDN18.2 O-GlcNAc化的关键位点，该修饰是其驱动肿瘤进展的分子基础。
5. 阐明O-GlcNAc化CLDN18.2促癌的下游信号通路： * 研究对象： 再次利用scRNA-seq数据、PDAC细胞系、PDO模型以及基因工程小鼠模型（KPC小鼠：LSL-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+；Pdx1-Cre 及其CLDN18.2条件性敲除品系）。 * 实验与方法： * 生物信息学分析： 从scRNA-seq数据中分析高CLDN18.2和高糖基化活性肿瘤细胞亚群中富集的信号通路。 * 信号分子检测： 通过免疫荧光和Western Blot检测CLDN18.2表达与Src酪氨酸激酶激活（以磷酸化Y419位点p-Src(Y419)为标志）的相关性。 * 分子互作机制探究： 通过Co-IP系统研究CLDN18.2与Src的相互作用，并利用Src的SH2、SH3结构域缺失突变体确定相互作用的关键区域。检测O-GlcNAc化对CLDN18.2酪氨酸磷酸化水平的影响，以及其与酪氨酸磷酸酶PTP1B的结合情况。 * 功能回复实验： 在CLDN18.2 T204A突变体细胞中使用Src激活剂YEEI肽段，观察能否回复其促迁移、侵袭表型；在体内模型中验证Src激活剂是否能消除不同CLDN18.2基因型组间的表型差异。 * 数据与结果分析： scRNA-seq分析发现，高CLDN18.2/高糖基化亚群显著富集Src_UP信号通路。实验证实，CLDN18.2过表达增加p-Src(Y419)水平，而其敲低则降低该水平。重要的是，CLDN18.2 WT能激活Src，而T204A突变体则不能。机制上，O-GlcNAc化的CLDN18.2与磷酸酶PTP1B的结合减弱，导致其自身酪氨酸磷酸化水平持续升高。磷酸化的CLDN18.2通过其磷酸化酪氨酸与Src的SH2结构域特异性结合，从而激活Src。Src激活剂YEEI肽段可以在体外和体内完全回复T204A突变体在迁移、侵袭和EMT等方面的功能缺失，证明O-GlcNAc化CLDN18.2主要通过激活Src通路来驱动PDAC进展。
6. 开发并验证协同治疗策略： * 研究对象： KRAS G12D突变的PDO模型、KPC基因工程小鼠模型、以及源自KRAS G12D PDAC患者的hPDX模型（包括原位和皮下模型）。 * 实验与方法： * 剂量探索与协同效应评估： 在PDO中测试不同浓度MRTX1133对CLDN18.2 O-GlcNAc化的抑制效果。使用SynergyFinder软件分析CLDN18.2 mAb与低剂量MRTX1133联合应用的协同效应（采用零交互作用效力模型）。 * 体内疗效与安全性评估： 在KPC小鼠和hPDX模型中，设置对照组、CLDN18.2 mAb单药组、标准剂量MRTX1133单药组、低剂量MRTX1133单药组、以及CLDN18.2 mAb分别与标准剂量或低剂量MRTX1133的联合治疗组。评估指标包括小鼠生存期、原发肿瘤体积/重量、肝转移发生率、HBP通路基因表达和UDP-GlcNAc代谢物水平。同时监测体重、肝肾功能等指标以评估安全性。 * 数据与结果分析： 低剂量MRTX1133（200 nM，约为标准剂量的1/4）即可有效抑制CLDN18.2的O-GlcNAc化。联合治疗在PDO模型中显示出显著的协同促凋亡效应。在多种体内模型中（KPC、hPDX），CLDN18.2 mAb联合低剂量MRTX1133的治疗方案，在显著抑制原发肿瘤生长、减少肝转移、延长生存期的同时，其疗效与联合标准剂量MRTX1133的方案相当，且均优于任一单药治疗。重要的是，低剂量联合方案并未增加不良反应，甚至在肝功能损伤方面优于标准剂量联合方案，显示出更好的安全性。
三、 主要研究结果 本研究通过上述系统性的工作流程，逐步揭示了从临床现象到分子机制再到治疗策略的完整科学故事。主要结果可概括为： 1. 临床相关性确立： CLDN18.2的胞浆定位（cyto-CLDN18.2）是PDAC患者不良预后的独立预测因子，且与CLDN18.2靶向治疗耐药直接相关。 2. 核心机制发现： KRAS突变和高血糖协同驱动CLDN18.2蛋白C末端第204位苏氨酸（T204）发生O-GlcNAc化修饰。 3. 功能后果阐明： T204位的O-GlcNAc化削弱了CLDN18.2与紧密连接支架蛋白ZO1的结合，导致CLDN18.2在胞浆内积累，无法正常定位于细胞膜。 4. 促癌信号通路解析： 胞浆中的O-GlcNAc化CLDN18.2，因其修饰减弱了与磷酸酶PTP1B的相互作用，维持了自身的酪氨酸磷酸化状态。磷酸化的CLDN18.2募集并激活Src酪氨酸激酶（通过其SH2结构域），进而驱动肿瘤细胞的迁移、侵袭、EMT和转移。 5. 治疗新策略验证： 低剂量的KRAS G12D抑制剂MRTX1133能够有效降低CLDN18.2的O-GlcNAc化水平，使其重新定位于细胞膜。将低剂量MRTX1133与CLDN18.2靶向抗体联合使用，在临床前模型中产生了显著的协同抗肿瘤效应，且安全性良好。这为KRAS突变型PDAC的治疗提供了一种新颖的联合策略。
四、 研究结论与价值 本研究的核心结论是：KRAS突变和宿主高血糖状态通过诱导CLDN18.2蛋白T204位点的O-GlcNAc化，改变其亚细胞定位，将其从抑癌的膜定位状态转变为促癌的胞浆定位状态。胞浆中的O-GlcNAc化CLDN18.2通过激活Src信号通路，促进PDAC的侵袭转移，并导致其对CLDN18.2靶向治疗产生耐药。这项研究不仅揭示了CLDN18.2在PDAC中疗效不佳的深层机制，更重要的是，提出了一个可转化的临床解决方案：利用低剂量KRAS抑制剂（如MRTX1133）来“逆转”CLDN18.2的不利修饰，从而使其对靶向抗体治疗重新敏感。
其科学价值在于：首次系统阐述了CLDN18.2的翻译后修饰（O-GlcNAc化）如何动态调控其功能与定位，并将上游的致癌信号（KRAS突变）、代谢环境（高血糖）与下游的促癌