研究报告：糖原合成酶激酶3通过抑制β-catenin对Akt的激活来驱动胸腺细胞迁出
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由Liu et al.团队完成，主要通讯作者为Wen-hsien Liu、Guo Fu和Changchun Xiao，第一作者为Chenfeng Liu、Lei Ma和Yuxuan Wang。研究主要依托于厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室、细胞信号网络协同创新中心，合作机构包括中南大学第二湘雅医院和斯克里普斯研究所。研究成果以题为“Glycogen synthase kinase 3 drives thymocyte egress by suppressing β-catenin activation of Akt”的研究论文形式，发表于2021年10月8日的期刊Science Advances上（卷7，文献号eabg6262）。
二、 学术背景与研究目标
本研究属于免疫学领域，聚焦于T细胞在胸腺内的发育成熟过程，特别是成熟胸腺细胞（单阳性胸腺细胞，SP）从胸腺迁出至外周循环的具体调控机制。
成熟的T细胞在胸腺中经历复杂的发育、选择、成熟过程后，需要成功迁出胸腺才能加入外周T细胞库，执行免疫功能。胸腺细胞的迁出主要由鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的浓度梯度驱动，而胸腺细胞表面S1P受体1（S1P1）的表达是其响应该信号的关键。研究表明，转录因子Foxo1及其下游靶基因Klf2调控着S1P1的表达。当胸腺细胞通过T细胞受体（TCR）接受到自我肽-MHC复合物的强信号时，会激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt通路，进而磷酸化Foxo1，导致其被泛素-蛋白酶体途径降解，最终使Klf2和S1P1表达下调，胸腺细胞滞留在胸腺内进行负向选择或进一步成熟。然而，在成熟的、TCR信号减弱的胸腺细胞中，Foxo1如何恢复活性并驱动S1P1表达上调，从而促进迁出的具体上游调控机制尚不完全清楚。
糖原合成酶激酶3（GSK3）是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，最初因其在糖代谢中的作用而被发现，后续研究揭示其在细胞分化、增殖和存活等多种生物学过程中扮演重要角色，包括对T细胞发育和功能的调节。然而，以往研究多依赖化学抑制剂或单个基因敲除，未能完全揭示其在生理条件下的确切功能。本研究的目标在于：利用T细胞特异性条件性双敲除小鼠模型，明确GSK3在胸腺细胞迁出过程中的生理性作用，并深入探索其发挥作用的分子机制。
三、 详细研究流程
研究采用了一套严谨的、从表型观察到机制探索，再到功能验证的多层次、系统性工作流程。
流程一：构建模型与表型确认。 首先，研究团队通过将携带条件性敲除等位基因的GSK3α-fl/fl和GSK3β-fl/fl小鼠与在T细胞（从双阳性阶段开始）特异性表达Cre重组酶的CD4-Cre小鼠杂交，成功构建了T细胞特异性GSK3α/β双敲除（DKO）小鼠模型。免疫印迹证实了在DKO小鼠的胸腺细胞中GSK3蛋白的缺失。对DKO小鼠的表型分析发现：① 外周淋巴器官（脾脏和淋巴结）中CD4+和CD8+ T细胞的数量和比例显著减少；② 胸腺内，虽然双阴性（DN）和双阳性（DP）胸腺细胞基本正常，但成熟单阳性（SP）胸腺细胞减少，并且具备迁出能力（表型为TCRhiCD69lo）的成熟SP胸腺细胞亚群几乎完全缺失；③ 体外存活实验显示，DKO SP胸腺细胞更易发生凋亡，且细胞体积增大、增殖增加。
流程二：迁出缺陷的直接验证与相关分子表达分析。 为直接证实迁出障碍，研究进行了体内荧光标记实验。将荧光素异硫氰酸酯（FITC）直接注射到小鼠胸腺内以标记胸腺细胞。24小时后，在野生型小鼠的外周可检测到约1-2%的FITC+ T细胞（即近期胸腺迁出者），而在DKO小鼠外周几乎检测不到，同时其胸腺内FITC+ SP胸腺细胞大量积累。这直接证明了GSK3缺失导致胸腺细胞迁出严重受损。进一步流式细胞术分析发现，DKO SP胸腺细胞无法正常下调CD69（一种迁出抑制分子），也无法上调S1P1和CCR7（一种促进胸腺内迁移和外周归巢的趋化因子受体）的表达。体外Transwell迁移实验证实，DKO SP胸腺细胞对S1P和CCR7配体CCL19的趋化反应能力显著下降。
流程三：排除TCR谱系偏倚的影响。 为了排除GSK3缺失可能通过影响TCR信号选择和胸腺细胞存活间接导致迁出障碍的假说，研究引入了OT-II（CD4+ TCR转基因）和P14（CD8+ TCR转基因）背景。在具有固定TCR特异性的DKO小鼠中，胸腺细胞迁出障碍、S1P1表达下调等表型依然存在，表明该表型并非由TCR谱系改变引起。此外，混合骨髓嵌合体实验证明，GSK3调控迁出的作用是细胞自主性的。
流程四：转录组学与信号通路初探。 通过对野生型和DKO小鼠的DP、CD4 SP、CD8 SP胸腺细胞进行RNA测序和生物信息学分析，研究人员发现GSK3缺失显著改变了细胞的基因表达谱。通路富集分析提示，GSK3调控的基因涉及淋巴细胞迁出、趋化因子信号等。更重要的是，分析指向Foxo1-Klf2信号通路可能受到GSK3的调控。随后的免疫印迹实验证实，在DKO SP胸腺细胞中，Klf2和Foxo1的蛋白水平显著降低，而β-连环蛋白（β-catenin）的蛋白水平却异常累积。
流程五：核心信号轴的确定与功能拯救。 基于上述发现，研究聚焦于Akt-Foxo1-Klf2轴。结果显示，即使在无刺激状态下，DKO SP胸腺细胞中Akt的磷酸化水平（活化标志）也高于野生型，Foxo1的磷酸化水平升高且总蛋白减少，Klf2蛋白减少。这表明GSK3缺失导致了Akt信号的异常激活和Foxo1-Klf2轴的下调。 为了验证这一机制，研究进行了三组关键的功能拯救实验： 1. 表达持续激活的Foxo1：将携带对Akt磷酸化不敏感的Foxo1突变体（Foxo1AAA）转基因的DKO小鼠进行杂交。结果显示，Foxo1AAA的表达能有效恢复DKO小鼠外周T细胞数量、胸腺细胞CD69下调、S1P1上调以及体外迁移能力。 2. 表达显性失活（Dominant Negative， DN）的Akt：通过逆转录病毒将Akt DN突变体导入DKO小鼠的骨髓细胞，然后重建免疫缺陷小鼠。Akt DN的表达能显著拯救DKO胸腺细胞的迁出表型，恢复Klf2和Foxo1表达。 3. 敲除β-catenin：将DKO小鼠与β-catenin条件性敲除（Ctnnb1-fl/fl）小鼠杂交。令人瞩目的是，在GSK3双敲除的基础上再敲除β-catenin，可以完全逆转胸腺细胞迁出障碍、恢复S1P1等分子的正常表达，并使异常的Akt活化和Foxo1/Klf2下调恢复正常。
流程六：β-catenin激活Akt的分子机制探究。 研究进一步探究了“GSK3缺失 → β-catenin累积 → Akt激活”这一新信号通路的细节。 1. 相互作用与定位：免疫共沉淀和免疫荧光实验证明，β-catenin能与Akt直接结合，并且在细胞膜/细胞质中共定位。 2. 功能验证：在野生型胸腺细胞或小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中过表达一个不能被GSK3磷酸化因而稳定的β-catenin突变体（CTNNB1 S33Y），足以在无生长因子刺激的情况下激活Akt，并导致Foxo1磷酸化和降解。 3. 机制阐释：进一步分子实验发现，β-catenin的累积并不影响Akt的上游激酶（如PI3K， PDK1）的活性，但会减少Akt与其磷酸酶PHLPP2和PP2A的相互作用。这导致Akt的去磷酸化（失活）过程受阻，从而维持其持续激活状态。 4. 核转位非必需：研究还构建了一个通过豆蔻酰化修饰被限定在细胞膜/细胞质（无法进入细胞核）的β-catenin突变体。实验证明，这种无法发挥经典转录激活功能的β-catenin，同样能有效激活Akt。这揭示了β-catenin在细胞质中具有独立于其核内转录功能的全新信号作用。
四、 主要研究结果
本研究的结果环环相扣，逻辑链条清晰： 1. 表型结果：明确建立了GSK3对于胸腺细胞存活、增殖（次要）和外迁（核心）不可或缺的生理功能。数据包括外周T细胞极度减少、FITC标记实验显示迁出阻断、以及CD69/S1P1/CCR7等迁移相关分子表达紊乱。 2. 机制上游结果：发现GSK3缺失导致β-catenin在胸腺细胞胞质中异常累积，而非预期的核内聚集。这是连接GSK3与下游表型的关键中间步骤。 3. 信号通路结果：揭示了β-catenin累积通过直接结合Akt、干扰其与磷酸酶的相互作用，导致Akt持续性激活。这解释了为何在无强TCR信号刺激时，DKO胸腺细胞中仍存在活跃的Akt磷酸化。 4. 下游效应结果：异常的Akt活化引发了Foxo1的过度磷酸化和降解，进而使其下游靶基因Klf2和S1P1的表达下调，最终导致胸腺细胞失去迁出能力。 5. 功能验证结果：三组拯救实验（表达持续活性的Foxo1、抑制Akt活性、敲除β-catenin）从不同节点上成功逆转了DKO的表型，强有力地证实了“GSK3 –| β-catenin –> Akt –| Foxo1 -> Klf2/S1P1 -> 迁出”这一完整的信号传导通路。
五、 研究结论与意义
本研究的核心结论是：组成性表达的GSK3通过不断磷酸化并降解β-catenin，抑制了后者在细胞质中对Akt的异常激活，从而确保了Foxo1-Klf2-S1P1轴的正常功能，驱动成熟胸腺细胞从胸腺迁出。这揭示了一条全新的、不依赖于Wnt信号和β-catenin核转录功能的GSK3-β-catenin-Akt信号轴。
科学价值： 1. 阐明了胸腺细胞迁出的关键上游驱动力：研究提出了一个精妙模型：在胸腺髓质中，胸腺细胞的命运受到三种力量的制衡：① 强TCR信号（导致负向选择）；② 包括残留TCR信号在内的“强直性信号”（Tonic Signaling），若不受控会抑制迁出；③ 组成性活化的GSK3（作为“默认”通路，持续抑制β-catenin-Akt轴，驱动迁出）。GSK3的发现填补了迁出“默认”驱动力机制的空白。 2. 揭示了β-catenin的非经典功能：研究首次在生理条件下证实，β-catenin在细胞质中可以作为Akt的共激活因子，其功能独立于经典的核内转录调控。这扩展了对β-catenin生物学功能的认识。 3. 为癌症研究提供了新视角：许多癌症中存在Wnt/β-catenin通路突变导致β-catenin累积。本研究提示，β-catenin的致癌作用可能不仅通过激活核内靶基因，还可能通过激活细胞质中的Akt信号来实现。这为理解癌症发生和设计靶向疗法提供了新思路。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究还附带了一些有价值的发现：GSK3缺失也影响了SP胸腺细胞的存活、大小和增殖，这可能也与异常的Akt激活有关。此外，在引入固定TCR的实验中，GSK3缺失可能改变了负向选择的阈值，导致部分本可存活的克隆被清除，这提示GSK3-Akt轴在胸腺选择中也扮演着精细调控的角色。这些发现为进一步研究GSK3在T细胞发育其他环节的作用提供了线索。