综合脂质组学、转录组学与网络药理学分析揭示当归补血汤治疗2型糖尿病肾病的作用机制

作者与发表信息

本文所报道的研究由兰州大学药学院的孙丽丽（lili sun）、杨志刚（zhigang yang）等研究人员共同完成，通讯作者为杨志刚。该研究发表于《Journal of Ethnopharmacology》第283卷，论文编号114699，于2021年10月2日在线发表。

研究背景

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病最严重的微血管并发症之一，可导致肾小球基底膜增厚、肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终发展为终末期肾病。目前临床上仅依靠肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）和蛋白尿难以在早期识别具有进展风险的糖尿病患者，因此亟需寻找新的特异性生物标志物。脂质代谢紊乱在DN发病中起着关键作用，脂质组学能够系统揭示肾脏病变表型相关的脂质变化，而转录组学则可以从基因表达层面阐明调控机制。

当归补血汤（danggui buxue decoction，DBT）是出自李东垣《内外伤辨惑论》的经典名方，由当归（angelicae sinensis radix，DG）和黄芪（astragali radix，HQ）两味药组成，具有益气生血之功效。前期研究和本实验室工作已发现DBT对DN具有治疗作用，但其深层机制尚不明确。本研究旨在通过整合脂质组学、转录组学和网络药理学分析，系统揭示DBT改善DN小鼠肾脏损伤的作用机制，并为其活性成分提供理论依据。

研究流程

本研究采用高脂饲料联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导建立2型糖尿病肾病小鼠模型。实验共使用50只五周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠，随机分为对照组（10只）和造模组（40只）。造模组饲喂高脂饲料并在10周后腹腔注射70 mg/kg STZ，随后将糖尿病小鼠随机分为模型组、阳性对照组（格列美脲0.4 mg/kg）、DBT高剂量组（9.4 g/kg）和DBT低剂量组（4.7 g/kg），灌胃给药每日一次，持续4周。实验结束取肾脏组织分为三部分，分别用于脂质组学分析、HE染色病理检查和转录组学测序。

首先，研究人员对DBT提取物进行了高效液相色谱（HPLC）定性定量分析，确定了其中6种主要成分：毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷（calycosin-7-glucoside）、阿魏酸（ferulic acid）、芒柄花苷（ononin）、毛蕊异黄酮（calycosin）、芒柄花素（formononetin）和藁本内酯A（levostilide A）。HE染色结果显示，模型组小鼠出现肾小球基底膜显著增厚、肾小球肥大、肾小管上皮细胞空泡样变性及球囊壁节段性粘连扩张等典型病理改变，而DBT治疗组上述病变明显减轻。

在脂质组学分析中，肾组织样品经液氮研磨后用甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）提取脂质，采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC-Q Exactive MS）在正负离子模式下进行数据采集。原始数据经Progenesis QI软件进行峰对齐、峰提取和归一化处理，随后导入SIMCA P14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1且t检验P<0.05为标准筛选潜在生物标志物，并通过METLIN、Lipid Maps、Lipid Bank和HMDB等在线数据库进行结构鉴定。通路富集分析由MetaboAnalyst 4.0完成，受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）用于评估生物标志物的诊断效能。

转录组学测序由上海ApexBio生物技术公司完成。取对照组、模型组、阳性对照组和DBT高剂量组肾组织，用TRIzol试剂提取总RNA，构建cDNA文库后在Illumina Nova 6000平台上进行RNA-seq测序。原始数据已存入NCBI数据库（登录号PRJNA 687119）。差异表达分析采用DESeq2，以FDR<0.05且|log2 fold change|>1为阈值筛选显著差异基因，并利用clusterProfiler包进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。测序原始序列数据也已提交至NCBI的SRA数据库。

网络药理学分析中，通过文献调研筛选DBT吸收入血的活性成分，利用STITCH和Swiss Target Prediction数据库预测其人类靶点蛋白，同时从TTD、CTD和OMIM数据库获取DN相关靶点，取交集得到36个共同靶点。KEGG富集分析由Metascape平台完成，化合物-靶点-通路（compound-target-pathway，C-T-P）网络由Cytoscape 3.7.1构建。

主要研究结果

脂质组学共鉴定出31个显著变化的脂质代谢物。与对照组相比，模型组小鼠肾脏中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholines，LysoPCs）和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamines，LysoPEs）含量下调，而磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines，PCs）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PEs）水平明显升高。鞘脂代谢方面，神经酰胺（ceramides，Cers）和鞘磷脂（sphingomyelins，SMs）中多数分子种含量显著增加。ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）大于0.9，表明所筛生物标志物具有良好的敏感性和可靠性。通路富集分析显示甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇锚生物合成、醚脂代谢和花生四烯酸代谢等通路受到扰动。DBT治疗后，上述异常代谢变化趋于正常水平。

转录组学分析鉴定出88个差异表达基因，其中53个上调、35个下调。KEGG富集分析显示的甘油磷脂代谢和鞘脂代谢通路与脂质组学结果相互印证。综合两种组学数据发现，模型组肾脏中编码鞘脂代谢酶的DEGS2和CERS基因表达上调，而编码神经酰胺酶的ACER2表达下调；编码PDK1和LPAR2的基因表达同样出现变化。这些基因表达的改变与脂质组学所观察到的Cers和SMs积累高度一致。DBT干预可下调DEGS2和CERS的转录水平，并通过上调ACERS和PDK1的表达促进Akt磷酸化，从而减少肾脏脂质积累、改善胰岛素抵抗。

网络药理学分析筛选出DBT中31种入血成分，其中黄芪贡献20种（包括黄芪甲苷IV、芒柄花素、山柰酚、毛蕊异黄酮等），当归贡献11种（包括阿魏酸、咖啡酸、绿原酸等）。KEGG富集分析表明，这些成分主要通过AGE-RAGE信号通路、PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等糖尿病并发症相关信号通路发挥作用。C-T-P网络分析显示，山柰酚、阿魏酸和黄芪甲苷IV等成分可能通过调控VEGFA、ACE、NOS2、NOS3和MAP3K5等靶点参与DBT对DN的药理活性的调节。

结论与意义

本研究首次整合脂质组学、转录组学和网络药理学三个层面的系统分析手段，揭示了DBT治疗DN的作用机制。结果表明，DBT主要通过调节甘油磷脂代谢和鞘脂代谢、改善炎症状态和胰岛素抵抗来减轻DN肾脏损伤。具体而言，DBT中的活性成分（黄芪甲苷IV、阿魏酸、山柰酚等）通过作用于VEGFA、ACE、NOS2、NOS3和MAP3K5等靶点，下调DEGS2和CERS基因表达，减少PCs、PEs、Cers和SMs的积累，部分经由AGE-RAGE、鞘脂代谢及多种炎症相关信号通路发挥作用。本研究为阐明DBT治疗DN的有效物质基础和作用机制提供了理论依据，所发现的鞘脂类潜在生物标志物有望为DN早期诊断提供参考。研究局限在于关键基因仍需进一步验证，鞘脂作为潜在生物标志物的临床应用也需扩大样本量和临床试验加以确证。

研究亮点

本研究的创新性主要体现在三个方面：其一，在方法学上首次将脂质组学与转录组学联合分析，并结合网络药理学进行系统整合，从代谢表型、基因表达和药物靶点三个维度交叉验证DBT的作用机制；其二，在研究对象上聚焦于能够反映肾脏局部病变的组织脂质组，而非血液或尿液，更贴近DN的肾脏病理生理过程；其三，通过多组学数据整合，构建了DBT多成分-多靶点-多通路的作用网络模型，为中药复方系统药理学研究提供了可借鉴的范式。