2019年，由Tina Uroda、Eleni Anastasakou、Annalisa Rossi、Jean-Marie Teulon、Jean-Luc Pellequer、Paolo Annibale、Ombeline Pessey、Alberto Inga、Isabel Chillón及Marco Marcia等人组成的国际研究团队，在《分子细胞》（*Molecular Cell*）期刊上发表了一项题为《Conserved pseudoknots in lncRNA MEG3 are essential for stimulation of the p53 pathway》的重要研究成果。这项研究主要在欧洲分子生物学实验室（EMBL）格勒诺布尔分部、特伦托大学、格勒诺布尔阿尔卑斯大学的结构生物学研究所（IBS）、马克斯·德尔布吕克中心和柏林大学等多个机构完成。该研究首次深入揭示了长链非编码RNA（lncRNA）的三维结构基序如何直接调控其生物学功能，特别是阐明了lncRNA MEG3通过形成特定的“假结”（pseudoknots）结构来激活p53肿瘤抑制通路的具体分子机制。
研究的学术背景与目标
长链非编码RNA（lncRNA）在染色质重塑、DNA修复、翻译调控等关键细胞过程中扮演着重要的调节分子角色。然而，与信使RNA（mRNA）或核糖体RNA（rRNA）等不同，lncRNA的结构（特别是高级三维结构）与其复杂功能之间的直接关联长期以来一直难以被系统性地阐明。这主要归因于lncRNA分子通常尺寸巨大、结构复杂，给生物物理学研究带来了前所未有的挑战。
人类母系表达基因3（Maternally Expressed Gene 3， MEG3）是一个典型的肿瘤抑制lncRNA。在成人细胞中，MEG3能够刺激p53通路，诱导细胞周期停滞和凋亡，从而抑制肿瘤进展。在多种人类癌细胞系和垂体腺瘤等原发性肿瘤中，MEG3的表达常因DNA甲基化而下调，其外源性表达则能减缓肿瘤进程，凸显了其作为肿瘤抑制因子的关键作用。先前的研究表明，MEG3能与p53蛋白相互作用，并上调p53靶基因的表达。MEG3存在至少27种可变剪接变体，它们对p53通路的刺激能力各异，并且MEG3的功能性区域缺失会损害其对p53的激活作用。然而，MEG3的结构基础，特别是其高级结构如何决定其功能，一直是一个未解之谜。
因此，本研究的核心目标是：解析MEG3的二级和三级结构，鉴定其发挥p53刺激功能的核心结构域，并阐明特定三级结构基序（如假结）对于MEG3生物学功能的必要性。这项研究旨在填补lncRNA结构-功能关系领域的知识空白，为理解这一重要肿瘤抑制RNA的作用机制提供全新的见解。
详细的研究流程与方法
研究团队采用了一种整合多种体外和体内技术的系统性方法，将结构生物学、生物化学、细胞生物学和进化分析紧密结合。整个工作流程可以概括为以下几个主要阶段：
第一阶段：MEG3剪接变体的鉴定、表达与初步结构表征 研究首先选取了三种具有代表性的人MEG3剪接变体进行研究：最丰富的变体V1（MEG3）、对p53通路刺激程度最低的变体V3（MEG3Δ）以及刺激程度最高的变体V9（MEG3ε）。研究团队在体外表达并纯化了这些RNA，确保了样本的均一性（通过天然琼脂糖凝胶电泳、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析超速离心等多种技术验证）。随后，他们利用多种化学探针（1M7， 1M6， NMIA， DMS）进行体外选择性2’-羟基酰化分析（SHAPE），绘制了这三种变体的二级结构图谱。通过计算分析，他们确定了MEG3包含五个结构域（D1-D5），其中D2和D3域构成了一个结构稳定、在不同变体间保守的核心区域。该核心区域恰好对应于外显子E3。进化分析进一步证实，E3是MEG3在哺乳动物中序列和二级结构最保守的区域，提示其功能重要性。
第二阶段：基于细胞的功能性筛选以定位关键功能域 为了将结构与功能联系起来，研究团队在表达野生型p53但内源性MEG3水平极低的HCT116人结肠癌细胞系中，进行了一系列系统的细胞功能实验。他们采用了荧光素酶报告基因实验（检测p53转录活性）和细胞周期分析（检测G1/S期阻滞）。通过构建一系列MEG3 V1变体的结构域或外显子缺失突变体，并测试它们激活p53报告基因的能力，研究发现： 1. D1， D4， D5结构域对于p53刺激是非必需的。 2. 删除D2或D3则会完全废除MEG3的活性。 3. 只有包含D2-D3的外显子E3本身，就足以激活p53通路。 4. D2和D3在“反式”（即分别共转染）条件下也能部分协同发挥功能。 这些结果将MEG3的p53刺激核心精确锁定在D2-D3结构域。
第三阶段：精细突变剖析核心域内的关键功能基序 在确定了D2-D3核心域后，研究团队进行了更精细的缺失和点突变分析。他们发现： 1. 删除D2域内的茎环结构H11，或删除D3域内包含串联重复序列（tandem repeats， TRs）的H25-H29区域，会严重损害MEG3的功能。 2. 在高度保守的H11茎环结构中，破坏其双链螺旋结构的突变会废除功能，而引入能恢复碱基配对的补偿性突变则可以挽救功能，证明H11的结构本身至关重要。 3. 更关键的是，将H11末端环（loop）中的核苷酸（GUGAG基序）突变为腺嘌呤（H11LPA突变体），或进行单点突变（如G370C），会几乎完全消除MEG3刺激p53通路和诱导细胞周期停滞的能力。这强烈暗示H11末端环中的特定核苷酸参与了关键的分子相互作用。
第四阶段：探究关键基序的作用机制——排除蛋白质结合，发现长程RNA-RNA相互作用 起初，研究者猜测H11可能是一个蛋白质（如p53）的结合位点。然而，RNA免疫共沉淀（RIP）和RNA pull-down实验表明，功能缺陷的H11LPA突变体与p53的结合能力与野生型MEG3相当。此外，通过比较细胞体内（in vivo）和温和裂解提取后（ex vivo）的SHAPE反应性（差值分析），发现在H11区域没有显著差异，提示该区域在细胞内可能未与蛋白质发生强烈相互作用。这些结果排除了H11作为主要蛋白结合位点的可能性。
研究者的注意力转向了H11可能参与分子内长程相互作用的假设。他们注意到，H11末端环（GUGAG）的序列与D3域内H27茎环附近的一系列6个串联重复序列（TR1-TR6）高度互补。进化分析显示，这种互补性在多种哺乳动物的MEG3同源物中是保守的。这提示H11和H27可能通过碱基配对形成“假结”或“环环相吻”（kissing loops）的三级结构。
为了验证这一假设，研究团队进行了多项体外结构分析： 1. 分析超速离心（AUC）：发现与野生型V1相比，H11LPA突变体在镁离子存在下的溶液构象紧凑度降低了约8%，表明H11的完整性对维持MEG3的正确折叠至关重要。 2. 羟基自由基足迹分析（HRF）：显示在H11LPA突变体中，不仅H11的GUGAG基序，连远端的H27区域的溶剂可及性也显著增加，证明这两个空间上分离的基序在结构上是相互关联的。 3. 原子力显微镜（AFM）成像：直观地展示了MEG3 V1在镁离子诱导下从松散的多域结构转变为致密的球状结构。而H11LPA突变体则丧失了这种紧凑折叠的能力，其AFM图像和功率谱密度（PSD）分析更类似于仅存在钾离子时的中间状态，而非紧凑状态。
第五阶段：功能互补实验确证假结的功能必要性 为了在功能上证明H11与H27之间的直接相互作用，研究团队进行了经典的补偿性突变实验。他们以功能受损的G370C单点突变体（位于H11环）为基础，在H27的各个串联重复（TR1-TR6）中引入理论上能恢复碱基配对的补偿性点突变，构建了多个双突变体。荧光素酶报告基因实验显示，除了一个双突变体外，其他多个双突变体都能在不同程度上部分或完全恢复MEG3对p53通路的刺激活性（针对p53LUC或pGL-MDM2报告基因）。其中，针对TR3的补偿性突变（G370C/U869G）挽救效果最为显著。这一结果提供了确凿的证据，表明H11和H27之间通过碱基配对形成的长程三级相互作用，对于MEG3的肿瘤抑制功能是必不可少的。
主要研究结果与逻辑推进
本研究取得了环环相扣、相互印证的一系列重要结果： 1. 结构域图谱与功能核心定位：成功绘制了MEG3多个剪接变体的二级结构，发现D2-D3结构域构成一个进化保守、结构稳定的核心。细胞功能筛选实验直接证明该核心是激活p53通路所必需且充分的最小单元。 2. 关键功能基序的鉴定：精细突变分析揭示了H11茎环（特别是其末端环的GUGAG基序）和H27串联重复序列是核心域内的两个关键功能元件。 3. 机制排除与假说建立：实验排除了H11作为主要蛋白结合位点的可能性，转而通过序列互补性和进化保守性提出了H11与H27形成分子内“假结”的假设。 4. 结构-功能关联的直接证据： * *体外证据*：AUC、HRF和AFM数据显示，破坏H11（H11LPA突变）会同时改变H11和H27的结构状态，并阻碍MEG3整体的三级结构紧凑化。这从生物物理角度证明了两个远端基序的结构耦合。 * *体内功能证据*：补偿性突变实验提供了最直接的遗传学证据。在H11上引入破坏相互作用的突变导致功能丧失，而在H27上引入能恢复相互作用的补偿突变则能挽救功能，完美地证实了二者之间的碱基配对相互作用是功能的分子基础。 5. 对p53通路影响的具体表征：研究进一步证实，功能丧失的H11突变体（H11LPA， G370C）不仅不能激活p53报告基因和诱导细胞周期阻滞，也无法像野生型MEG3那样上调内源性p53蛋白水平及其下游靶基因（如BAX， P21）的表达。
这些结果层层递进，从宏观结构域定位到微观核苷酸功能，从排除一种作用机制到证实另一种更精妙的作用机制，最终将MEG3的高级RNA结构与其关键的肿瘤抑制功能直接联系起来。
研究的结论与价值
本研究得出明确结论：lncRNA MEG3中高度保守的H11和H27基序通过形成分子内假结（环环相吻）相互作用，构成了其三级功能核心。这种特定的RNA高级结构基序对于MEG3的正确折叠及其激活p53肿瘤抑制通路的能力至关重要。
这项研究的科学价值和应用前景非常显著： 1. 开创性意义：它首次系统地将lncRNA的特定三级结构基序（假结）与其明确的生物学功能（激活p53）直接关联起来，解决了该领域长期存在的关键难题，为理解lncRNA的作用机制提供了全新的范式。 2. 机制新见解：揭示了与以往研究不同的作用模式。不同于许多lncRNA功能基序作为蛋白质结合“枢纽”，MEG3的H11-H27假结是一个分子内结构支架，其作用可能是正确空间组织MEG3的功能域，以利于其与合作伙伴（如p53）的相互作用或精准调控基因表达。 3. 治疗与诊断潜力：研究提示，稳定MEG3的H11-H27假结结构可能成为增强p53反应、治疗相关肿瘤（如某些垂体腺瘤、脑膜瘤）的新策略。同时，筛查MEG3基因中尤其是H11和H27区域的结构破坏性突变，或可作为癌症易感性的新型生物标志物。 4. 方法论示范：本研究展示了一套整合进化分析、体外生物物理、单分子成像和体内细胞功能验证的研究lncRNA结构-功能的强大方法学体系，为未来研究其他lncRNA奠定了技术基础。
研究亮点
其他有价值的观点
研究还提出了一个有趣的模型：H27区域存在多个串联重复序列，它们可能与H11末端环发生互斥的交替性结合，形成多种略微不同的构象。这种冗余性可能使MEG3能够微调其对不同p53靶基因的刺激特异性，为理解lncRNA如何实现精细调控提供了新的思考维度。此外，研究确认了MEG3除了结合p53外，其D3、D4、D5等区域还存在其他蛋白质结合位点，这为未来全面绘制MEG3相互作用组、深入理解其完整的调控网络指明了方向。