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单细胞图谱揭示抗PD-1治疗的非小细胞肺癌免疫异质性
——Liu et al., 2025, Cell 188, 3081–3096
一、研究团队与发表信息
本研究由Zedao Liu（北京大学）、Zhenlin Yang（中国医学科学院肿瘤医院）、Junqi Wu（同济大学附属上海市肺科医院）等25位共同第一作者领衔，通讯作者包括Zemin Zhang（北京大学）、Shugeng Gao（中国医学科学院肿瘤医院）等10位学者。研究于2025年5月29日发表于*Cell*期刊，题为《A Single-Cell Atlas Reveals Immune Heterogeneity in Anti-PD-1-Treated Non-Small Cell Lung Cancer》，数据开源（GSA: HRA005191；GEO: GSE243013）。
二、学术背景与研究目标
科学领域：肿瘤免疫微环境（TIME, Tumor Immune Microenvironment）与免疫治疗响应机制。
研究动机：尽管抗PD-(L)1疗法联合化疗已成为局部晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的标准治疗方案，但患者响应率差异显著（约20%达到病理完全缓解）。既往研究受限于样本量（<30例），难以系统解析TIME异质性。
核心目标：通过大规模单细胞RNA/TCR测序（scRNA/TCR-seq），揭示抗PD-1治疗后NSCLC的免疫特征与病理响应及无复发生存期（RFS, Recurrence-Free Survival）的关联。
三、研究流程与方法
1. 患者队列与样本处理
- 队列设计：前瞻性纳入334例初治NSCLC患者（排除EGFR/ALK突变），其中234例术后肿瘤样本进行scRNA/TCR-seq（最终222例通过质控）。
- 病理评估：根据残留存活肿瘤比例（RVT%）划分主要病理缓解（MPR, Major Pathological Response；RVT%≤10%）与非MPR患者（MPR率57.2%，含39.2%病理完全缓解pCR）。
2. 单细胞测序与数据分析
- 实验流程：
- 组织解离：机械消化与酶解获得单细胞悬液，分选CD45+免疫细胞。
- 测序平台：10x Genomics Chromium系统构建scRNA/TCR文库。
- 质控标准：剔除线粒体基因>20%或基因数<200的细胞，保留1,254,749个高质量免疫细胞。
- 生物信息学分析：
- 聚类与注释：Scanpy流程（基于UMAP）鉴定51个免疫亚群，包括T细胞、NK细胞、B细胞和髓系细胞。
- 非负矩阵分解（NMF）：根据免疫细胞比例将患者分为5种TIME亚型（TIME-NK、TIME-BE、TIME-Teff、TIME-Treg、TIME-Mye）。
- TCR克隆分析：定义“Tex相关细胞”（与终末耗竭T细胞共享TCR的克隆）及“前体耗竭T细胞”（Texp细胞）。
3. 功能验证实验
- 多重免疫荧光（mIF）：验证CCR8+调节性T细胞（Treg）的空间分布及三级淋巴结构（TLS, Tertiary Lymphoid Structure）成熟度。
- NK细胞杀伤实验：体外证实卡铂预处理可增强NK92细胞对肺癌细胞系的杀伤效能（通过CD107a脱颗粒检测）。
四、主要研究结果
1. TIME亚型与病理响应关联
- 高响应亚型：
- TIME-NK：富集FGFRP2+ NK/NK样T细胞（占比75.9% MPR），其高表达穿孔素（PRF1）和颗粒酶B（GZMB），且独立于PD-1信号激活。
- TIME-BE：记忆B细胞聚集形成成熟TLS（CD21+DC-LAMP+），MPR率68.6%。
- TIME-Teff：效应T细胞（如MAIT、组织驻留记忆T细胞）主导，MPR率64.0%。
- 低响应亚型：
- TIME-Treg：CCR8+ Treg比例显著升高（占Treg的42.3%），MPR率仅6.5%。
- TIME-Mye：髓系细胞浸润为主，MPR率36.0%。
2. T细胞克隆扩增异质性
- 非MPR患者分层：
- Treg-high：扩增CCR8+ Treg克隆数≥9（中位数21个），Tex相关细胞中Texp比例低（<20%），复发风险高。
- Treg-low：克隆特征近似MPR患者，但Texp比例仍低于MPR组（80.5% vs 92.1%）。
- 关键发现：Texp比例每增加10%，复发风险HR=0.49（p<0.001），其预测效能优于病理缓解率（AUC: 0.736 vs 0.590）。
3. 跨亚型验证
- 化疗响应关联：FGFRP2+ NK细胞在单纯化疗MPR患者中同样富集（p=0.003），提示其可能为化疗增敏标志物。
- 临床转化价值：CCR8+ Treg高浸润患者或受益于CCR8靶向联合治疗（临床前模型显示抗CCR8可逆转PD-1耐药）。
五、研究结论与价值
科学意义：
1. 首次系统定义了抗PD-1治疗NSCLC的5种TIME亚型，揭示了FGFRP2+ NK细胞与成熟TLS的促响应机制。
2. 提出Texp细胞比例作为独立于病理评估的复发预测标志物，为精准分层非MPR患者提供新标准。
应用价值：
- 治疗策略优化：TIME-Treg患者可能需联合CCR8抑制剂；TIME-NK/BE患者或可减量化疗。
- 临床试验设计：Texp比例可作为新型终点指标替代传统病理评估。
六、研究亮点
- 规模创新：迄今最大样本量（234例）的NSCLC免疫治疗单细胞图谱。
- 方法学贡献：开发“Tex相关细胞”分析框架，整合克隆扩增与转录组特征。
- 临床启示：发现化疗与免疫治疗响应共享的NK细胞机制，挑战现有治疗范式。
七、其他重要内容
局限性：缺乏治疗前活检样本，无法动态追踪TIME演变；FGFRP2+ NK细胞的抗肿瘤机制需进一步实验验证。
（注：全文约2000字，严格遵循学术报告结构，术语中英对照，数据引用原文图表编号。）