该研究由Yi-Ting Chen、Ming-Ming Jiang、Carolina Leynes、Mary Adeyeye、Camilla F. Majano、Barakat Ibrahim、Urszula Polak、George Hung、Zixue Jin、Denise G. Lanza、Lan Liao、Brian Dawson、Yuqing Chen-Evenson、Oscar E. Ruiz、Richard J. Gibbons、Jason D. Heaney、Yangjin Bae和Brendan Lee等人共同完成，他们分别来自Baylor College of Medicine、University of Texas Health Science Center at Houston、Rice University、University of Oxford等机构。该研究于2025年1月2日发表在*The Journal of Clinical Investigation*期刊上，文章标题为“ATRX silences CART expression in osteoblastic cells during skeletal development”。

学术背景

该研究主要聚焦于ATRX（ATP-dependent chromatin remodeling protein，ATP依赖性染色质重塑蛋白）在骨骼发育中的作用。ATRX是一种染色质重塑蛋白，参与多种细胞过程，包括染色质状态的维持、DNA结构的稳定以及基因表达的调控。ATRX的突变与多种疾病相关，例如X连锁α-地中海贫血智力低下综合征（ATR-X syndrome）和多种癌症（如脑癌、胰腺癌、软组织肉瘤和骨肉瘤）。此前的研究表明，ATRX在骨骼发育中具有一定作用，但其具体机制尚不明确。该研究旨在探讨ATRX在骨骼发育中的功能，特别是其在成骨细胞（osteoblast）中对CART（cocaine- and amphetamine-regulated transcript，可卡因和安非他明调节转录物）表达的调控作用。

研究流程

该研究分为多个步骤，详细流程如下：

1. 小鼠模型的构建
   研究人员使用Osterix-Cre转基因小鼠与ATRX-floxed小鼠杂交，构建了成骨细胞特异性ATRX敲除小鼠模型（ATRX-CKO）。通过PCR基因分型确认小鼠基因型，并在小鼠出生后8周和1.5年时分别进行骨骼表型分析。

2. 骨骼表型分析
   通过micro-CT（微型计算机断层扫描）分析小鼠的骨结构，包括骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁间距（Tb.Sp）和皮质骨厚度（Ct.Th）等参数。结果显示，ATRX-CKO小鼠的骨小梁体积和数量显著增加，而骨小梁间距减少。

3. 骨组织形态计量学分析
   通过组织形态计量学分析，研究人员发现ATRX-CKO小鼠的破骨细胞（osteoclast）数量和表面积显著减少，而成骨细胞数量和骨形成率无明显变化。这表明ATRX缺失主要通过抑制破骨细胞分化来增加骨小梁体积。

4. 体外破骨细胞分化实验
   研究人员从小鼠骨髓中分离出骨髓基质细胞（BMSCs），并与野生型脾细胞共培养，进行破骨细胞分化实验。结果显示，ATRX-CKO小鼠的BMSCs显著抑制了破骨细胞分化，且RANKL（receptor activator of nuclear factor κ-B ligand，核因子κB配体受体激活剂）/OPG（osteoprotegerin，骨保护素）表达比例降低。

5. RNA测序分析
   对小鼠胫骨进行RNA测序（RNA-seq），发现ATRX-CKO小鼠中CART基因表达显著上调。通过基因本体论（GO）分析，发现上调基因显著富集于骨吸收的负调控过程。

6. CART表达验证
   通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色，研究人员发现CART肽在ATRX-CKO小鼠的骨组织中高度表达，且主要分布在成骨细胞谱系细胞中。ELISA实验进一步证实，ATRX-CKO小鼠血清中的CART肽水平显著升高。

7. ATRX和RUNX2结合位点分析
   通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和ChIP-qPCR，研究人员发现ATRX结合在CART基因的启动子区域，而RUNX2结合在CART基因的远端增强子区域。这表明ATRX通过结合CART启动子抑制其表达，而RUNX2则可能通过增强子区域促进其表达。

8. CART基因敲除实验
   研究人员使用CRISPR/Cas9技术在ATRX-CKO小鼠的BMSCs中敲除CART基因，发现RANKL/OPG表达比例显著升高，进一步证实了CART在骨吸收中的调控作用。

主要结果

1. ATRX缺失增加骨小梁体积
   ATRX-CKO小鼠的骨小梁体积和数量显著增加，而骨小梁间距减少，表明ATRX缺失通过抑制破骨细胞分化来增加骨量。

2. ATRX缺失抑制破骨细胞分化
   体外实验显示，ATRX-CKO小鼠的BMSCs显著抑制了破骨细胞分化，且RANKL/OPG表达比例降低。

3. CART基因表达上调
   RNA-seq和IHC实验证实，ATRX缺失导致CART基因在成骨细胞谱系细胞中高度表达，且血清CART肽水平显著升高。

4. ATRX和RUNX2结合位点
   ChIP-seq和ChIP-qPCR实验发现，ATRX结合在CART启动子区域，而RUNX2结合在CART的远端增强子区域，表明ATRX通过结合启动子抑制CART表达。

5. CART基因敲除实验
   CART基因敲除实验进一步证实，CART通过调控RANKL/OPG表达比例在骨吸收中发挥重要作用。

结论

该研究揭示了ATRX在骨骼发育中的重要作用，特别是其在成骨细胞中通过抑制CART表达来调控骨吸收的机制。ATRX缺失导致CART基因表达上调，进而抑制破骨细胞分化，增加骨小梁体积。这一发现为理解骨骼发育和骨吸收的分子机制提供了新的视角，并为骨质疏松等骨骼疾病的治疗提供了潜在靶点。

研究亮点

1. 重要发现
   该研究首次揭示了ATRX在成骨细胞中通过调控CART表达来抑制骨吸收的机制，为骨骼发育和骨代谢研究提供了新的分子机制。

2. 方法创新
   研究采用了多种先进技术，包括CRISPR/Cas9基因编辑、ChIP-seq、RNA-seq等，全面解析了ATRX和CART在骨骼发育中的功能。

3. 应用价值
   该研究为骨质疏松等骨骼疾病的治疗提供了潜在靶点，具有重要的临床应用价值。

其他有价值的内容

该研究还探讨了CART肽在骨吸收中的调控作用，为未来研究CART肽的受体及其下游信号通路提供了方向。此外，研究还发现ATRX缺失对雌性小鼠的骨量也有类似影响，这为研究性别差异在骨骼疾病中的作用提供了线索。

该研究通过系统的实验设计和深入的数据分析，揭示了ATRX在骨骼发育中的关键作用，为骨骼疾病的治疗提供了新的思路和靶点。