这是一项关于新型口服PI3K/HDAC双靶点抑制剂治疗肝细胞癌（HCC）的原创性研究。该研究由张克辉、刘俊义、毕金辉、林松文、吴德宇、李思源、宁乾辰、盛丽、葛俊普、徐恒及赖芳芳作为共同作者完成。其中，张克辉、徐恒和赖芳芳为共同通讯作者，他们均来自中国医学科学院和北京协和医学院药物研究所，依托天然药物及仿生药物国家重点实验室和北京市小分子免疫肿瘤药物发现与转化开发重点实验室。该论文以预校样（Journal Pre-proof）形式发表于《Chinese Chemical Letters》，于2026年3月31日收稿，2026年5月24日接收。
一、 研究背景与目的
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）占原发性肝癌的90%，是全球癌症相关死亡的第三大原因。目前的分子靶向药物（如索拉非尼）因耐药机制而疗效受限。在HCC中，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路的失调发生率高达40%-50%，而组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase，HDAC）抑制剂单药治疗也因肿瘤分布不佳和代偿通路激活而效果不佳。虽然联合使用PI3K和HDAC抑制剂能产生协同抗肿瘤效应，但其临床应用常受限于药物间不良相互作用和药代动力学缺陷。
两者联合抑制的理论基础在于它们对原癌基因蛋白c-Myc（Myc proto-oncogene protein，c-Myc）的共同调控：PI3K通路增强c-Myc蛋白的稳定性和翻译，而HDAC（尤其是HDAC3）则在表观遗传层面促进其表达。这种双重依赖性使得c-Myc对PI3K/HDAC的联合抑制极为敏感。然而，现有的双靶点抑制剂多针对血液肿瘤，且存在代谢不稳定、口服生物利用度低等缺点。因此，本研究旨在设计和合成一类结构新颖、具有良好口服生物利用度的PI3K/HDAC双靶点抑制剂，以协同下调c-Myc，探索其在HCC治疗中的潜力与机制。
二、 研究工作流程
本研究涵盖了从药物分子设计、体外活性筛选、作用机制探索到体内药效与安全性评价的全链条流程。
1. 分子设计与合成 研究团队采用药效团融合策略，选择4-甲基喹唑啉作为PI3K抑制药效团，并通过在该骨架的8号位引入不同连接基团，连接基于酰肼的锌离子结合基团（Zinc-Binding Group, ZBG），构建新型PI3K/HDAC双靶点抑制剂。该设计的创新之处在于采用酰肼基团作为ZBG，旨在改善化合物的代谢稳定性和药代动力学特征。研究共合成了30个化合物，并系统地探索了吡啶环上的取代基（R基团）以及连接区域的长度、柔性、含醚键等结构修饰对活性的影响。
2. 体外靶点抑制活性与选择性评价 研究者对所有合成化合物进行了针对PI3Kα和HDAC的酶水平抑制活性测试，以确立构效关系（Structure-Activity Relationship, SAR）。通过分子对接技术，预测了优选化合物与靶点蛋白（PI3Kα和HDAC1）的结合模式。接着，对选定的先导化合物33进行了针对PI3K和HDAC各亚型的选择性谱评估。
3. 细胞水平抗增殖活性与信号通路验证 研究选取了多种肿瘤细胞系，测试了化合物33的细胞增殖抑制活性，并与已上市或处于临床阶段的HDAC抑制剂SAHA和PI3K抑制剂BKM120的联合用药进行了比较。特别在HCC细胞系（如Huh-7和HepG2）中，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）技术，检测了化合物33对PI3K/AKT通路（检测磷酸化AKT和磷酸化GSK3β）和HDAC通路（检测乙酰化组蛋白H3和乙酰化p53）信号分子的影响。
4. 深入机制解析：c-Myc的下调及其介导的双重细胞死亡 为了验证抑制剂对c-Myc的协同调控假说，研究者在HCC细胞中进行了以下实验：首先，通过生物信息学分析临床数据库中c-Myc与PIK3CA、HDAC3表达的相关性及其对患者生存期的影响。其次，使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和WB技术，检测了化合物33对c-Myc信使RNA（mRNA）和蛋白水平的影响。为探究蛋白降解机制，研究者还检测了c-Myc的泛素化水平，并利用蛋白酶体抑制剂MG132进行了干预实验。
在验证c-Myc被有效下调后，研究进一步通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）等转录组学分析手段，预测c-Myc下游涉及的生物学通路，发现其与程序性细胞死亡和活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）产生相关。随后，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测了化合物33诱导的ROS水平变化，并使用小干扰RNA（siRNA）敲低c-Myc来验证其作用。最后，研究人员分别研究了ROS积累引发的两种程序性细胞死亡途径： - 细胞凋亡（Apoptosis）：通过膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）染色和流式细胞术检测凋亡细胞比例，并用WB检测凋亡相关蛋白（Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP）的表达。同样利用siRNA敲低c-Myc来确认其介导作用。 - 铁死亡（Ferroptosis）：基于c-Myc对铁死亡关键负调控因子核因子E2相关因子2（Nrf2）的转录调控作用，研究者通过WB检测了Nrf2的蛋白水平，并采用流式细胞术检测脂质过氧化这一铁死亡的标志性事件。再次使用c-Myc敲低实验，证实了该通路的上下游关系。
5. 体内药代动力学、药效及安全性评价 为评估成药性，研究首先在小鼠体内通过不同给药途径测试了化合物33的药代动力学（Pharmacokinetics, PK）参数。接着，构建了HepG2肝细胞癌异种移植瘤小鼠模型，分别通过腹腔注射和口服灌胃两种给药方式，观察肿瘤体积和重量的变化，以评价其体内抑瘤效果。通过WB和免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）技术对肿瘤组织进行分析，验证化合物在体内对靶点通路的影响和对增殖标记物Ki-67的抑制。此外，还在ES-2卵巢癌异种移植模型中评估了其广谱抗肿瘤活性。最后，通过在ICR小鼠上进行急性毒性实验，结合主要器官的组织病理学检查，初步评价了化合物的安全性。
三、 主要研究结果
1. 先导化合物的发现与活性验证 通过构效关系研究发现，在4-甲基喹唑啉吡啶环上的甲氧基取代和中等长度的含醚键连接基团，有利于获得平衡的PI3K和HDAC抑制活性。据此，先导化合物33被筛选出。它对PI3Kα的半数抑制浓度（IC50）为383 nmol/L，对I类HDAC（HDAC1,2,3,8）具有强效抑制活性，其中对HDAC3的抑制活性最高（IC50为18 nmol/L），而对IIa和IIb类HDAC基本无活性，显示出良好的选择性。分子对接模型显示，化合物33的喹唑啉骨架能与PI3Kα的铰链区结合，而其酰肼基团则以双齿方式与HDAC1的催化锌离子螯合。
2. 细胞活性和信号通路抑制 化合物33对多种肿瘤细胞系表现出抗增殖活性，尤其在HCC细胞系中效果显著，其对HepG2细胞的抑制活性（IC50值）比阳性药组合（SAHA + BKM120）低约7倍，显示出显著优势。WB实验证实，化合物33在Huh-7和HepG2细胞中能同时剂量依赖性地抑制PI3K/AKT通路（降低p-AKT和p-GSK3β水平）和HDAC活性（升高Ac-H3和Ac-p53水平）。
3. c-Myc的协同下调机制 生物信息学分析表明，PIK3CA和HDAC3在HCC组织中高表达，且与患者更短的总生存期相关。c-Myc的高表达同样预示HCC患者预后不良。实验证实，化合物33不仅显著抑制c-Myc的转录（降低mRNA水平），更主要通过促进其蛋白的泛素-蛋白酶体降解来降低c-Myc蛋白丰度。这是因为抑制PI3K通路后，活化的GSK3β会磷酸化c-Myc，促使其被泛素化降解。WB结果显示，33处理下c-Myc蛋白的泛素化水平升高，且蛋白酶体抑制剂MG132能逆转33引起的c-Myc蛋白下调。这证实了转录抑制和蛋白降解的双重作用机制。
4. 双重程序性细胞死亡的诱导 c-Myc的下调引起了细胞内ROS的大量积累，且这一效应在c-Myc敲低后显著减弱。ROS水平的急剧升高触发了两种细胞死亡模式：一方面，化合物33显著上调促凋亡蛋白Bax和切割型Caspase-3/PARP，诱导大量细胞凋亡，但这一现象在c-Myc被knockdown后得以缓解；另一方面，c-Myc的下调导致Nrf2蛋白水平下降，解除了对铁死亡的抑制，导致细胞脂质过氧化水平升高，诱导铁死亡发生。同样，敲低c-Myc可削弱这种效应。值得注意的是，经典的铁死亡诱导剂Erastin在这些肝癌细胞系中的效果有限，这突显了化合物33通过新机制诱导铁死亡的独特优势。
5. 体内药效与安全性 药代动力学研究显示，化合物33半衰期为1.19-2.02小时，口服生物利用度达36.0%，腹腔注射则为68.1%。在HepG2异种移植模型中，口服化合物33（90和120 mg/kg）的抑瘤率分别为61.59%和64.29%，超过了同等剂量下的阳性药联合组合（SAHA + BKM120，抑瘤率56.02%）。对肿瘤组织的WB和IHC分析证实，化合物33在体内仍然能够有效抑制PI3K/AKT信号、提升乙酰化组蛋白H3水平，并显著降低c-Myc和细胞增殖标志物Ki-67的表达。此外，在卵巢癌ES-2模型中，化合物33也显示出优于阳性组合的抑瘤效果。在急性毒性评估中，即使口服剂量高达1200 mg/kg，也未观察到主要器官的明显损伤，表明其具有良好的体内安全性。
四、 研究结论与价值
本研究成功设计和发现了一类以化合物33为代表的新型口服PI3K/HDAC双靶点抑制剂。其科学价值在于：首次揭示并详细阐明了通过协同下调c-Myc、进而同时诱导细胞凋亡和铁死亡的双重细胞死亡通路机制来高效杀伤肝细胞癌的新策略。这种由“单一分子-同一核心靶点（c-Myc）-双重死亡模式”构成的“死亡网络”，为克服肿瘤的异质性和耐药性提供了新颖思路。应用价值在于：化合物33不仅具有优异的体外抗HCC活性，更凭借其良好的口服生物利用度和体内安全性，在多个动物模型中展现了强大的抑瘤效果，因而被确立为一个极具前景的临床前候选药物，为非血液肿瘤特别是肝细胞癌的治疗带来了新的希望。
五、 研究亮点
本研究的主要亮点在于以下几个方面：其一，巧妙的设计策略：采用酰肼基团作为ZBG，成功改善了双靶点抑制剂的药代动力学性质，解决了该类化合物口服生物利用度低的普遍问题。其二，新颖的调控机制：揭示了PI3K和HDAC双重抑制如何从转录和翻译后修饰两个层面协同作用，实现对核心癌蛋白c-Myc的“逼近式”彻底清除。其三，独特的药效学模式：发现了该先导化合物通过c-Myc/Nrf2/ROS轴，不仅能诱导经典的细胞凋亡，还能有效诱导铁死亡，这种双重死亡的激活模式为开发更高效、不易耐药的抗肿瘤药物提供了新的理论依据和实践范例。其四，广泛的体内疗效与安全性平衡：该化合物在肝癌乃至卵巢癌模型中均表现出强大抗肿瘤活性，同时兼具良好的安全性，证实了其作为广谱抗实体瘤药物的潜力。