关于《氧化应激与PRKN介导的衰老将RhoA/ROCK信号与变应性鼻炎上皮重塑联系起来》研究的学术报告
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究的主要作者包括袁煊、钟伟、谢少冰、刘立源、顾文婧、曾艺翔、张华、江文红、谢志海（通讯作者）和郜培松（通讯作者）。研究团队来自多个知名机构，包括美国约翰斯·霍普金斯大学医学院过敏与临床免疫学部、中国中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科、苏州大学附属儿童医院呼吸内科以及湖南省耳鼻咽喉重大疾病研究重点实验室。
该研究以题为《Oxidative stress and PRKN-mediated senescence link RhoA/ROCK signaling to epithelial remodeling in allergic rhinitis》的原创研究论文形式，于2026年1月7日在线发表在学术期刊《Antioxidants》上（卷15，期1，文章号77）。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于变应性疾病（过敏性疾病）与呼吸道上皮生物学交叉领域，具体聚焦于变应性鼻炎（Allergic Rhinitis, AR）的发病机制。AR是一种影响全球超过5亿人的慢性上气道炎症性疾病，其经典机制以2型免疫反应（Th2）和IgE介导的炎症为核心。然而，越来越多的证据表明，鼻上皮的结构改变（即“上皮重塑”），包括上皮增厚、屏障功能破坏和杯状细胞化生，在疾病持续、症状严重程度以及对环境触发因素的易感性中起着关键作用。尽管如此，驱动AR中上皮重塑的上游因素和具体分子机制仍不明确。
RhoA是一种小GTP酶，作为细胞内信号转导的关键开关，当其被激活并与下游效应分子ROCK结合后，可调控细胞骨架、细胞连接和上皮屏障功能。先前研究提示RhoA/ROCK通路在哮喘等气道炎症中发挥作用，但该信号通路在AR中，特别是其通过非免疫机制（如氧化应激、细胞衰老）导致上皮重塑的具体作用，尚未被探索。同时，细胞衰老作为慢性炎症性疾病的标志，其分泌的衰老相关分泌表型（SASP）可加剧局部炎症和组织重塑，但鼻上皮细胞衰老在AR中的存在与功能意义同样未知。
基于以上背景，本研究旨在阐明以下几个关键科学问题：1）RhoA/ROCK信号在AR患者鼻黏膜中是否异常激活？2）该信号通路如何驱动AR的上皮氧化应激、衰老和重塑？3）其下游的关键分子机制是什么？研究目标是通过整合临床样本分析、基因工程小鼠模型、药理学干预和体外细胞实验，揭示连接Th2炎症与上皮功能障碍的新分子通路。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了多层次、多系统的综合性研究策略，流程严谨，环环相扣。
第一流程：临床样本表征与靶点发现。 研究首先纳入了20名AR患者和20名健康对照（HC），采集其下鼻甲黏膜活检组织和鼻腔灌洗液。通过苏木精-伊红（H&E）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色，定量分析了上皮厚度和杯状细胞密度，证实了AR患者存在显著的上皮重塑。免疫荧光染色显示AR患者上皮E-钙黏蛋白（屏障标志物）表达降低，而α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，上皮-间质转化标志物）表达升高。二氢乙啶（DHE）染色显示AR组织活性氧（ROS）积累增加。免疫组织化学证实了AR黏膜中IL-4, IL-5, IL-13等Th2细胞因子水平升高。为了寻找驱动这些表型的关键分子，研究者对8对匹配的AR/HC样本进行了批量RNA测序（RNA-seq）。生物信息学分析发现，RhoA是AR样本中上调最显著的基因之一。这一发现在扩大样本量（共40人）的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR） 和蛋白质印迹法（Western Blot，检测活性RhoA-GTP） 中得到验证。免疫荧光共定位进一步确认活性RhoA主要富集于鼻上皮细胞中，且其mRNA水平与患者的总鼻部症状评分（TNSS）和鼻结膜炎生活质量问卷（RQLQ） 评分呈正相关，提示RhoA激活与疾病严重程度相关。
第二流程：体内功能验证——基因与药理学干预。 为了在体内验证RhoA/ROCK信号的功能，研究构建了两种模型。首先，利用Cre-loxP系统，将表达在气道克拉拉细胞（Club cell）中的CC10-CreERT2小鼠与RhoA条件性敲除（Rhoa flox/flox）小鼠杂交，获得他莫昔芬诱导的上皮特异性RhoA敲除小鼠（Rhoa CKO）。通过基因型鉴定确认后，对Rhoa CKO及其对照（Rhoa fl/fl）小鼠建立屋尘螨（HDM）诱导的AR小鼠模型（致敏+激发）。其次，在野生型AR小鼠模型中，于激发阶段使用ROCK抑制剂法舒地尔（Fasudil）进行腹腔注射干预。评估指标包括：1）组织学（H&E/PAS染色评估重塑）；2）行为学（计数抓鼻和打喷嚏频率）；3）体液免疫（ELISA检测血清总IgE、HDM特异性IgE及鼻腔灌洗液NALF中的Th2细胞因子）；4）氧化应激与重塑标志物（DHE染色测ROS，免疫荧光测E-cadherin和α-SMA）。此外，为了验证上皮细胞自主效应，从野生型小鼠分离原代鼻上皮细胞（NECs），在气-液界面（ALI）培养体系中进行分化，然后用IL-13刺激，并加入法舒地尔共处理，检测ROS、上皮标志物和跨上皮电阻（TEER）以评估屏障功能。
第三流程：机制探索——细胞衰老的表征与功能。 基于RNA-seq数据的深入分析，研究者根据AR患者RhoA表达水平将其分为高RhoA组和低RhoA组。基因集富集分析（GSEA） 显示，高RhoA AR样本中衰老相关通路显著富集。通过qRT-PCR、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色以及免疫荧光检测经典衰老标志物（p16, p21, γH2AX），在AR患者和高RhoA亚组中证实了鼻上皮细胞衰老的增加。同时，ELISA检测到NALF中SASP因子（IL-1β, IL-6）水平升高。为了在功能上证明RhoA/ROCK调控衰老，在HDM诱导的Rhoa CKO小鼠和IL-13刺激的ALI-NECs（±法舒地尔）中，重复了上述衰老标志物的检测。为了直接证明衰老细胞在AR发病中的因果作用，研究使用了p16-3MR转基因小鼠。该小鼠的p16高表达细胞（衰老细胞）可被更昔洛韦（GCV）选择性清除。在建立HDM-AR模型的同时，用GCV处理以消除衰老细胞，随后评估其对炎症、氧化应激和上皮重塑的影响。
第四流程：下游分子机制挖掘与验证。 为了寻找RhoA调控衰老的下游关键节点，对高/低RhoA AR组的RNA-seq数据进行了基因本体（GO）富集分析，发现“活性氧代谢过程调控”是顶级富集通路之一。在该通路中，PRKN（Parkin） 基因——一个调控线粒体自噬（mitophagy）和线粒体稳态的关键因子——在AR黏膜中显著下调，且其表达与RhoA水平呈负相关。免疫荧光染色证实了AR患者鼻上皮中PRKN蛋白表达降低。为了验证PRKN的功能，研究构建了PRKN过表达（OE-PRKN）的人鼻上皮细胞（HNEPCs）。用IL-13刺激后，通过透射电子显微镜（TEM） 观察线粒体超微结构，JC-1染色评估线粒体膜电位，MitoSOX和H2DCFDA染色分别检测线粒体特异性ROS和总细胞内ROS，并通过SA-β-gal染色和衰老标志物免疫荧光评估细胞衰老情况，以明确PRKN过表达能否缓解IL-13诱导的线粒体功能障碍、氧化应激和细胞衰老。
数据分析：组间比较采用Student‘s t检验、Mann-Whitney U检验或单因素方差分析（ANOVA）及相应的事后检验。相关性分析采用Spearman秩相关。数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
四、 主要研究结果
结果一： 临床样本分析成功描绘了AR鼻黏膜的典型特征：显著的上皮增厚、杯状细胞增生、E-cadherin减少/α-SMA增加（提示EMT样改变）、ROS积累以及Th2细胞因子浸润。RNA-seq及后续验证一致性地发现RhoA是AR中上调最显著的基因之一，其活性形式（RhoA-GTP）主要位于上皮，且表达量与临床评分正相关，确立了RhoA作为关键候选靶点。
结果二： 体内功能实验提供了强有力的因果证据。上皮特异性敲除Rhoa（Rhoa CKO） 或药理学抑制ROCK（法舒地尔），均能显著减轻HDM诱导的小鼠AR表型。具体表现为：上皮增厚和杯状细胞化生减轻；打喷嚏和抓鼻行为减少；血清总IgE和HDM特异性IgE水平下降；NALF中IL-4、IL-5、IL-13浓度降低；组织ROS积累减少；上皮屏障标志物E-cadherin得以部分恢复，α-SMA表达降低。体外ALI实验进一步证实，法舒地尔可以逆转IL-13引起的小鼠NECs ROS升高、E-cadherin/α-SMA异常表达以及TEER下降。这些结果首次在体内外证明了上皮RhoA/ROCK信号是驱动AR Th2炎症、氧化应激和上皮重塑的上游枢纽。
结果三： 机制探索揭示了细胞衰老是连接RhoA与病理表型的关键环节。生物信息学分析显示高RhoA AR样本富集衰老通路。组织染色证实AR患者，尤其是高RhoA亚组，鼻上皮中SA-β-gal阳性细胞及p16、p21、γH2AX阳性细胞显著增多，且RhoA表达与这些衰老标志物正相关，SASP因子（IL-1β, IL-6）也同步升高。在机制上，Rhoa CKO小鼠和法舒地尔处理的ALI-NECs中，HDM或IL-13诱导的细胞衰老和SASP分泌被显著抑制。这直接证明了RhoA/ROCK信号正向调控上皮细胞衰老。
结果四： 清除衰老细胞可直接改善疾病。使用p16-3MR/GCV系统选择性清除衰老细胞后，HDM诱导的AR小鼠其上皮重塑、临床症状、Th2炎症和氧化应激均得到显著缓解。这一结果首次直接证实了衰老细胞在AR中不仅是伴随现象，而且是主动驱动疾病进展的效应细胞，通过分泌SASP维持炎症和重塑。
结果五： 研究成功定位到关键下游分子PRKN。GO分析将研究焦点引向氧化应激代谢通路，并发现线粒体质量控制关键蛋白PRKN在AR中表达下调，且与RhoA负相关。功能拯救实验表明，过表达PRKN能有效保护HNEPCs免受IL-13损伤：维持线粒体正常结构和膜电位；减少线粒体和总ROS的产生；显著降低SA-β-gal活性和p16/p21/γH2AX的表达。这阐明了RhoA/ROCK信号可能通过抑制PRKN，导致线粒体功能障碍、ROS爆发，最终诱发上皮细胞衰老的分子链条。
五、 研究结论与价值
本研究系统性地揭示了一条在AR发病中此前未被认识的核心分子通路：上皮细胞中异常激活的RhoA/ROCK信号，通过抑制PRKN介导的线粒体质量控制，导致氧化应激累积，进而诱发上皮细胞衰老；这些衰老细胞通过分泌SASP，放大并维持局部Th2炎症，并直接促进病理性上皮重塑。
其科学价值在于：1）拓展了对AR发病机制的理解，将研究视角从单纯的免疫细胞激活，延伸至上皮细胞自身应激（氧化应激、衰老）的核心作用，提出了“上皮驱动”的新范式。2）建立了新的机制链接，首次将RhoA/ROCK信号、PRKN依赖性线粒体功能障碍、细胞衰老和上皮重塑在AR中串联成一个完整的病理轴。3）发现了新的治疗靶点，不仅提示RhoA/ROCK抑制剂（如法舒地尔）的潜在治疗价值，更将PRKN和衰老细胞清除（Senolysis）策略推向前台，为开发针对难治性AR的新型疗法提供了理论依据和实验基础。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究在讨论部分也提出了前瞻性的思考，例如：氧化应激是过敏致敏的原因还是后果？除了PRKN，转录组分析还提示了ACE2、Fyn、Itgb2等其他可能与RhoA相关的氧化应激基因，值得未来探索。同时，作者也坦诚指出了本研究的局限性，如未探讨其他细胞类型中RhoA的作用、临床样本量可进一步扩大、法舒地尔可能存在脱靶效应等，并为未来研究指明了方向，如利用单细胞测序解析上皮衰老异质性、探索RhoA/ROCK调控PRKN的表观遗传机制、评估靶向该通路药物的临床前疗效等，体现了严谨的科研态度。