类型a：原创研究学术报告

一、主要作者与机构
本研究由Yuqi Wang、Mangze Hu、Yilong Zou和Xi Wang共同完成，作者单位包括西湖大学生命科学学院、西湖大学医学院及西湖实验室生命科学与生物医学中心。研究论文于2025年12月19日发表在期刊*STAR Protocols*（Volume 6, Article 104042），标题为《In vivo CRISPR screening protocol to identify metastasis mediators using iteratively selected mouse models》。

二、学术背景
该研究属于癌症生物学与基因功能筛选交叉领域，聚焦于卵巢癌转移机制的探索。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间组学技术能够描述肿瘤微环境的异质性，但这些方法无法直接建立基因功能与表型间的因果关系。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过高通量筛选为解析基因功能提供了新工具，但传统体外模型（in vitro）难以模拟体内（in vivo）复杂的微环境交互。因此，本研究开发了一种基于活体CRISPR筛选（in vivo CRISPR screening）的标准化流程，旨在克服体外模型的局限性，鉴定卵巢癌转移过程中的关键驱动基因。研究目标包括：
1. 设计并验证靶向转移相关基因的单向导RNA（sgRNA）文库；
2. 建立高转移性卵巢癌小鼠模型；
3. 通过活体筛选与生物信息学分析识别关键基因；
4. 对候选基因进行功能验证。

三、详细工作流程
研究共分为四个核心阶段，包含20余项具体操作步骤：

1. sgRNA文库设计与构建

   • 基因选择：从公共数据库（如GO、KEGG）筛选潜在转移相关基因，每个基因设计至少4条sgRNA以减少脱靶效应，并包含非靶向sgRNA作为阴性对照。
     
   • 文库合成与克隆：通过高通量合成服务生成sgRNA寡核苷酸池，经PCR扩增后与线性化载体（plenticrispr_v2）通过Gibson Assembly连接。
     
   • 电转与质粒提取：使用Endura电感受态细胞进行电穿孔，通过大培养皿扩增细菌后提取质粒（Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit）。文库质量通过二代测序（NGS）验证，要求sgRNA分布均匀（Gini系数<0.3）且零计数比例极低。
     

2. 活体CRISPR筛选

   • 慢病毒包装：将文库质粒与包装质粒（PLP1/PLP2/PLP-VSVG）共转染HEK293T细胞，48小时后收集病毒上清。
     
   • 细胞感染与移植：以低感染复数（MOI=0.3）感染高转移性卵巢癌细胞ES-2-MC2-HEP，筛选后通过腹腔注射移植至裸鼠（1×10^6细胞/只）。
     
   • 组织采集与gDNA提取：利用高盐沉淀法从小鼠肝/肺转移灶中提取基因组DNA（gDNA），并通过PCR扩增sgRNA区域用于测序。
     

3. 生物信息学分析

   • 数据预处理：使用MAGeCK算法（版本0.5.9.4）计算sgRNA丰度，通过RRA（Robust Rank Aggregation）或MLE（Maximum-Likelihood Estimation）模块分析基因必要性。
     
   • 可视化：通过R包MAGeCKFlute绘制Lorenz曲线、富集散点图等，筛选显著富集或缺失的sgRNA及其靶基因。
     

4. 功能验证

   • 候选基因敲除：以代谢酶NMNAT1为例，设计4条特异性sgRNA，构建稳定敲除细胞系并通过Western blot验证敲除效率（抗体：CST #98354S）。
     
   • 体内表型分析：比较对照组与敲除组小鼠的肝/肺转移负荷（通过离体生物发光成像BLI量化光子信号），发现NMNAT1缺失显著降低转移灶形成（p<0.01，n≥13）。
     

四、主要结果
1. 文库质量验证：成功构建包含7,000 sgRNA的文库，测序显示sgRNA分布均匀（Gini系数=0.21），覆盖度达500倍以上（图4）。
2. 活体筛选结果：与皮下肿瘤相比，肝/肺转移灶中NMNAT1靶向sgRNA显著富集（log2FC>2，FDR<0.05），提示其促进转移的作用（图5c）。
3. 功能验证：NMNAT1敲除使ES-2-MC2-HEP细胞的肝转移负荷降低67%，肺转移降低54%（图6b-c），证实其为转移依赖性基因。

五、结论与价值
该研究建立了一套标准化活体CRISPR筛选流程，首次揭示了NMNAT1在卵巢癌转移中的关键作用。科学价值在于：
1. 方法论创新：结合迭代选择的小鼠模型（ES-2-MC2-HEP）与高通量筛选，解决了跨器官转移研究的技术难题；
2. 临床意义：NMNAT1可作为潜在治疗靶点，为抑制转移提供新策略。

六、研究亮点
1. 技术整合性：首次将sgRNA文库设计、活体筛选、计算分析及功能验证整合为标准化协议；
2. 模型优势：迭代选择的ES-2-MC2-HEP模型具有高转移效率（肝/肺转移率>80%）；
3. 算法优化：通过MAGeCK-Flute实现多条件比较分析，降低体内异质性干扰。

七、其他价值
研究还提供了针对常见问题（如文库复杂度不足、gDNA污染）的解决方案，并开源了分析代码（GEO: GSE279723），为后续研究提供参考。