学术研究报告：青蒿琥酯（artesunate）与索拉非尼（sorafenib）协同诱导肝细胞癌铁死亡（ferroptosis）的研究

作者及发表信息

本研究由Zhong-Jie Li（第一作者）、Hui-Qi Dai、Xiao-Wei Huang等16位作者合作完成，主要来自广西医科大学（Guangxi Medical University）生理学系、毒理学系等机构，通讯作者为Ji-Gang Wang、Jing Zhou和Guo-Dong Lu。研究发表于Acta Pharmacologica Sinica期刊（2021年42卷，301-310页），DOI: 10.1038/s41401-020-0478-3，2020年7月22日在线发表。

研究背景

该研究聚焦于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的治疗困境。HCC占原发性肝癌的90%，5年生存率仅约15%。索拉非尼作为晚期HCC的一线药物，仅能延长患者2-3个月的生存期，且存在毒性耐受和获得性耐药问题。因此，寻找增效组合策略成为当务之急。

研究团队基于以下科学背景展开工作： 1. 铁死亡机制：铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性程序性细胞死亡，由脂质过氧化（lipid peroxidation）引发。索拉非尼可通过抑制SLC7A11（胱氨酸转运体）耗竭谷胱甘肽（glutathione, GSH），而青蒿琥酯通过溶酶体（lysosome）介导的铁蛋白自噬（ferritinophagy）增加游离铁，两者靶向铁死亡的不同环节。 2. 药物特性：青蒿琥酯是抗疟药物青蒿素的衍生物，临床耐受性好、成本低廉，且已有研究表明其可独立于SLC7A11诱导铁死亡。

研究目标为：验证青蒿琥酯与低剂量索拉非尼联用的协同效应，阐明其通过线粒体（mitochondria）和溶酶体双重途径诱导铁死亡的分子机制。

研究流程与方法

1. 体外细胞实验

研究对象：Huh7、SNU-449、SNU-182和HepG2四种HCC细胞系。

实验设计： - 协同效应验证：通过MTT法检测不同浓度组合（青蒿琥酯25 μM + 索拉非尼0.5-2 μM）对细胞增殖的抑制，使用CompuSyn软件计算联合指数（combination index, CI）。 - 细胞死亡机制： - 采用PI（碘化丙啶）排除法和亚G1期检测分析细胞死亡。 - 使用特异性抑制剂（如NAC清除ROS、Liproxstatin-1抑制脂质过氧化、Deferoxamine螯合铁）验证铁死亡。 - 克隆形成实验：低剂量药物处理10天后结晶紫染色，ImageJ分析克隆数量。

2. 体内小鼠实验

动物模型：20只BALB/c裸鼠，皮下接种Huh7细胞（5×10^6个/只），肿瘤体积达80-100 mm^3后随机分组： - 对照组（PBS） - 青蒿琥酯单药组（30 mg/kg） - 索拉非尼单药组（20 mg/kg） - 联合治疗组 隔日灌胃给药，监测肿瘤体积和体重变化。

组织分析： - H&E染色观察细胞死亡区域。 - 免疫组化（IHC）检测Ki-67（增殖标志物）、铁蛋白轻链（FTL）表达。 - 生化试剂盒测定肿瘤组织中MDA（丙二醛）、游离Fe^2+含量。

3. 机制研究实验

• 氧化应激检测：DCFDA检测总ROS，MitoSOX Red检测线粒体ROS，TMRE（四甲基罗丹明甲酯）测线粒体膜电位。
• 代谢分析：Seahorse代谢仪测定氧消耗率（OCR），ATP含量检测。
• 溶酶体功能：LysoTracker Red标记溶酶体酸性，Magic Red试剂检测组织蛋白酶B/L（cathepsin B/L）活性。
• 蛋白表达：Western blot分析铁蛋白（FTL/FTH）、转铁蛋白受体（TFRC）等蛋白水平。

特殊方法

• 铁死亡特异性检测：联合使用Liproxstatin-1（脂质过氧化抑制剂）和Deferoxamine（铁螯合剂）区分铁死亡与其他细胞死亡方式。
• 溶酶体抑制实验：Bafilomycin A1阻断溶酶体酸化，验证铁蛋白降解途径。

主要研究结果

1. 体外协同效应

• 增殖抑制：联合用药对Huh7、SNU-449、SNU-182的抑制率显著高于单药（P<0.01），CI值证实协同作用。
• 死亡机制：联合治疗导致的细胞死亡可被NAC和铁死亡抑制剂逆转，但不受凋亡（Z-VAD）、坏死性凋亡（Necro-1）或焦亡（Belnacasan）抑制剂影响。
• 脂质过氧化：联合组MDA水平较单药组升高2-3倍，BODIPY C11荧光探针显示脂质过氧化增强。

2. 体内抗肿瘤效果

• 肿瘤生长：联合组肿瘤体积较对照组减少67%（P<0.01），显著优于单药组。
• 病理改变：H&E显示联合组出现大面积细胞死亡（核固缩、细胞形态崩解），Ki-67阳性率下降80%。

3. 分子机制

• 线粒体功能障碍：索拉非尼（2 μM）单独处理即可降低线粒体膜电位（TMRE信号减弱50%），联合组OCR检测显示ATP合成减少60%。
• 溶酶体激活：青蒿琥酯显著增强溶酶体酸性（LysoTracker信号增加3倍）和组织蛋白酶B/L活性（P<0.01），Bafilomycin A1预处理可阻断FTL降解。
• 铁代谢改变：联合组肿瘤组织游离Fe^2+含量增加2.5倍，Western blot显示FTL和TFRC蛋白水平下降。

研究结论

1. 协同机制：索拉非尼通过抑制SLC7A11耗竭GSH并损伤线粒体功能，青蒿琥酯激活溶酶体促进铁蛋白降解，两者共同增强脂质过氧化和铁死亡。
2. 临床意义：青蒿琥酯可降低索拉非尼有效剂量（体外仅需2 μM），减轻毒性；二者均为临床可用药物，转化潜力大。
3. 科学价值：首次阐明铁死亡双通路（氧化应激+铁蛋白自噬）协同作用，为HCC联合治疗提供新靶点。

研究亮点

1. 创新性机制：提出”线粒体-溶酶体轴”协同诱导铁死亡的模型（如图6d所示）。
2. 方法学贡献：建立铁死亡特异性检测体系（结合脂质过氧化和铁螯合抑制剂）。
3. 转化医学价值：青蒿琥酯作为增效剂的低成本优势，适用于广泛HCC人群。

其他价值

研究者建议后续工作可拓展至： - 原发肝癌动物模型（如DEN诱导）和PDX模型。 - 基于ACSL4等生物标志物的个性化治疗筛选。