基于磁性固相萃取与液相色谱-串联质谱联用技术的继发性高血压生物标志物同步定量研究

作者及发表信息
本研究由Xi Gao（中国科学院大学生命科学学院、BGI Genomics）、Xiaoyong Li（南方科技大学第二附属医院深圳市第三人民医院国家感染性疾病临床研究中心）等共同完成，通讯作者为Siqi Liu（中国科学院大学）和Qunjie Wang（Biosepur公司）。论文发表于*Rapid Communications in Mass Spectrometry*期刊2024年第38卷第6期，开放获取（DOI: 10.1002/rcm.9703）。

学术背景
继发性高血压（secondary hypertension）常由多器官内分泌系统异常激活引发，其诊断依赖于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPAA）相关标志物，如血管紧张素（angiotensins, Angs）、醛固酮（aldosterone, Ald）和皮质醇（cortisol, Cor）。传统免疫检测法（如ELISA）因抗体特异性差异导致不同厂商试剂盒数据不可比，且需分步检测，操作繁琐。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术虽能实现多分子同步定量，但面临血浆中目标物富集效率低、自动化程度不足的挑战。本研究旨在开发一种结合磁性固相萃取（MSPE）与LC-MS/MS的高效方法，实现Ang II、Ald和Cor的同步精准定量，为临床诊断提供新工具。

研究流程与方法
1. 样本收集与处理
- 样本来源：72例人血浆样本（男性52例，女性20例，年龄18-81岁）取自深圳市第三人民医院，采集后3小时内离心分离血浆，-80℃保存。
- 标准品制备：Ang I、Ang II、Ang 1–7、Ald和Cor标准品溶解后梯度稀释，同位素标记物（如Ang II-13C,15N）作为内标。

1. 磁性固相萃取优化

   • 材料筛选：评估5种MSPE磁珠（HLB、PS、CPS、PLS、C18）对目标物的富集效率。
     
   • 富集流程：磁珠活化后与血浆样本孵育，磁场分离后洗脱，冻干复溶。HLB磁珠（亲水-亲脂平衡材料）对Angs（回收率72.8%-80.7%）、Ald（89.7%）和Cor（95.5%）富集效果最优。

2. LC-MS/MS方法开发

   • 色谱条件：C18色谱柱，流动相为含1‰甲酸的水/甲醇梯度洗脱（6分钟内完成分离）。
     
   • 质谱参数：正离子模式SRM（选择反应监测），优化碰撞能量（如Ang II：524.1→263.3，CE 31 V）。
     
   • 方法验证：线性范围（Angs 7.81–4000 pg/ml，Ald 31.25–2000 pg/ml，Cor 7.81–500 ng/ml）、日内/日间精密度（CV <10%）、基质效应（偏差<20%）。

3. 稳定性与相关性分析

   • Angs稳定性：血浆室温放置3小时内，Ang II浓度稳定，而Ang I和Ang 1–7随时间显著升高（EDTA抑制ACE/ACE2活性导致降解受阻）。
     
   • 方法对比：LC-MS/MS与商业ELISA结果高度一致（Pearson相关系数：Ald 0.896，Cor 0.895，Ang II 0.835）。

主要结果
1. 富集效率：HLB磁珠对多肽（Angs）和疏水性分子（Ald、Cor）的同步富集能力显著优于其他材料（如C18对Angs回收率极低）。
2. 方法性能：LC-MS/MS在宽浓度范围内呈现优异线性（R²>0.99），且抗基质干扰能力强，满足临床检测要求。
3. 标志物相关性：Ang II与肾素活性显著相关（r=0.835），支持其作为RAAS激活的可靠指标；Ang I和Ang 1–7因稳定性差不适合单独作为标志物。
4. 临床一致性：与免疫法相比，LC-MS/MS数据更接近多实验室报告范围（如Ang II：18.24±10.62 pg/ml vs. ELISA 53.32–94.51 pg/ml），凸显方法标准化优势。

结论与价值
1. 科学价值：首次建立基于HLB-MSPE与LC-MS/MS的继发性高血压三联标志物（Ang II、Ald、Cor）同步定量方法，解决了免疫法特异性差、步骤繁琐的问题。
2. 应用价值：
- 诊断优化：Ang II的稳定性验证为其临床推广提供依据，可替代传统肾素活性检测。
- 技术革新：MSPE自动化潜力显著，未来可整合至高通量筛查平台。
3. 观点创新：提出血浆Ang II动态变化受EDTA影响机制，为样本处理标准化提供理论支持。

研究亮点
1. 方法创新：HLB磁珠首次应用于多极性差异分子的同步富集，突破传统SPE限制。
2. 技术整合：LC-MS/MS方法兼顾灵敏度（LOQ达pg级）与通量（6分钟/样本）。
3. 临床意义：明确Ang II作为肾素活性替代标志物的地位，推动精准诊疗。

其他发现
- 标志物组合：Ang II+Ald+Cor三联检测可覆盖RAAS和HPAA异常，优于单一指标。
- 跨平台数据：LC-MS/MS在多中心研究中表现更稳定，有望成为行业金标准。