这篇由张玉新、张玉洁、陶海粟、朱敬涵、卢远祥、程方玲、熊祎晓、刘俊杰、蔡广臻、张占国、梁慧芳、陈益发、张万广等研究人员合作完成的研究，于2023年发表于*Cancer Letters*期刊。

该研究聚焦于肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma， HCC）治疗领域的重要临床挑战。仑伐替尼（Lenvatinib）是治疗晚期HCC的标准一线药物之一，但绝大多数患者最终会产生获得性耐药，导致治疗失败。目前，仑伐替尼耐药的分子机制尚不完全清楚，这限制了开发有效策略来克服耐药性。氧化还原稳态在肿瘤耐药中扮演关键角色。癌细胞通过重塑活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）平衡和上调抗氧化能力来适应治疗压力，从而促进生存并导致耐药。线粒体自噬（Mitophagy）是清除受损线粒体、维持ROS稳态的重要过程。同时，长链非编码RNA（long noncoding RNA， lncRNA）在许多癌症的进展和耐药中发挥调控作用，但其在HCC仑伐替尼耐药中的具体功能和机制，尤其是与线粒体自噬和氧化还原稳态的关联，尚属未知。因此，本研究旨在探究lncRNA在HCC仑伐替尼耐药中的作用，特别是通过调控线粒体自噬和抗氧化通路来影响ROS稳态的机制，以期发现新的治疗靶点和策略。

本研究包含一套系统、严谨且多维度的研究流程，整合了临床样本分析、细胞与动物模型、功能验证、机制探索以及新型临床前模型验证等多个层面。

首先，研究人员从临床出发，收集了三组HCC患者样本。第一组为92对HCC肿瘤与癌旁组织，用于分析linc01607、miR-892b和p62的表达及相关性。第二组为来自同一中心的20例患者组织（12例仑伐替尼敏感，8例耐药），用于验证linc01607和p62在耐药患者中的表达。疗效评估遵循RECIST 1.1标准，将疾病进展（Progressive Disease， PD）定义为耐药，部分缓解（Partial Response， PR）或疾病稳定（Stable Disease， SD）定义为敏感。第三组为新鲜手术组织，用于建立患者来源的类器官（Patient-derived organoid， PDO）模型，以在体外评估仑伐替尼敏感性及不同干预措施的效果。这为后续机制研究提供了坚实的临床相关性基础，并引入了能更好反映肿瘤异质性的PDO模型。

其次，在体外研究中，研究团队使用Hep3B和Huh7两种HCC细胞系，通过长期、梯度递增仑伐替尼浓度暴露的方法（持续约10个月），构建了稳定的仑伐替尼耐药（LR）细胞系。通过CCK-8等实验检测了耐药细胞与亲本敏感细胞的半数抑制浓度（IC50），确认了耐药表型。随后，利用RNA测序（RNA-seq）分析LR细胞与亲本细胞的差异表达基因，并结合全基因组CRISPR-Cas9筛选（CRISPR-seq）数据，聚焦于linc01607这一在LR细胞中显著上调的lncRNA。该整合分析策略有效缩小了关键调控分子的筛选范围。为验证功能，研究通过转染小干扰RNA（siRNA）或过表达质粒，在细胞中敲低或过表达linc01607，并通过CCK-8、细胞凋亡（流式细胞术）、克隆形成等实验评估其对仑伐替尼敏感性的影响。为探索linc01607对线粒体自噬的调控，研究采用了多种实验方法：Western Blot检测自噬标记物LC3-II/I和p62、线粒体自噬特异性蛋白PINK1和Parkin的表达；通过细胞分馏分离线粒体，检测线粒体内相关蛋白；使用共聚焦显微镜观察线粒体（用hBAD-mito-DsRed标记）与自噬体（用AD-GFP-LC3标记）的共定位；以及透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy， TEM）直接观察细胞内的自噬体和线粒体形态。这些多角度的证据共同证实了线粒体自噬的水平。此外，研究使用流式细胞术检测细胞内ROS水平，并使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine， NAC）或氧化剂过氧化氢（H2O2）处理细胞，以验证ROS水平变化与耐药性的因果关系。

第三，在机制探索层面，研究深入解析了linc01607的作用模式。通过核质分离和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）确定linc01607主要定位于细胞质，提示其可能作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA， ceRNA）发挥作用。利用RNA反义纯化（RNA Antisense Purification， RAP）结合高通量测序（RAP-seq）技术，寻找与linc01607直接结合的miRNA，并锁定miR-892b为潜在靶点。这一技术直接捕获了RNA-RNA相互作用。随后，通过双荧光素酶报告基因实验（将野生型或突变型的linc01607序列克隆至报告载体），验证了linc01607与miR-892b的直接结合。RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation， RIP）实验使用Ago2抗体，进一步证实了linc01607、miR-892b与RNA诱导沉默复合体（RISC）的结合。对于下游靶基因p62的确认，研究整合了RNA-seq（上调基因）、CRISPR-seq（负筛选基因，即敲除后降低耐药的基因）和已知的自噬相关基因集，取交集后通过qRT-PCR验证，发现p62是关键基因。同样，通过双荧光素酶报告基因实验（靶向p62 mRNA的3‘非翻译区）和RIP实验，证实了miR-892b可直接靶向并抑制p62的表达。为阐明linc01607/miR-892b/p62轴如何影响抗氧化通路，研究检测了核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）及其下游抗氧化基因（GPX4， HO-1， NQO1）的表达。通过Western Blot、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）分析了p62与Keap1、Nrf2的相互作用。尤为关键的是，研究通过生物信息学预测和染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation， ChIP）实验，结合ChIP-PCR，发现Nrf2能够直接结合到linc01607的启动子区域，并通过双荧光素酶报告基因实验（构建linc01607启动子野生型和突变型报告载体）证实Nrf2可转录激活linc01607的表达，从而揭示了一个正反馈调控环路。

第四，在体内验证阶段，研究构建了HCC原位肝移植瘤模型和皮下移植瘤模型。将亲本或LR细胞注射至裸鼠体内，通过小动物活体成像监测肿瘤生长。对荷瘤小鼠给予仑伐替尼治疗、或联合使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine， CQ）、或联合shRNA敲低linc01607等处理。实验结束后，取出肿瘤组织称重，并通过流式细胞术检测肿瘤组织内ROS水平，通过免疫组化（Immunohistochemistry， IHC）分析相关蛋白表达。这些体内实验有力地支持了体外发现的结论。最后，研究利用前述建立的HCC患者来源类器官模型，在体外模拟了仑伐替尼单药、敲低linc01607单用以及两者联合的治疗效果，通过监测类器官形态、活性和直径变化，评估了靶向linc01607在更具临床相关性的模型中的治疗潜力。

本研究取得了系统性的重要结果，环环相扣，逐步揭示了linc01607驱动仑伐替尼耐药的全新机制。

研究起始于对临床耐药样本和细胞模型的观察。结果显示，与仑伐替尼敏感患者或亲本细胞相比，耐药患者肿瘤组织和LR细胞中的氧化应激标记物（8-OHdG和4-HNE）水平降低，基础及仑伐替尼处理后的细胞内ROS水平也显著降低，表明耐药状态下抗氧化能力增强。功能实验发现，ROS清除剂NAC能部分挽救仑伐替尼在亲本细胞中诱导的死亡，但在LR细胞中无效；相反，外源性添加氧化剂H2O2能部分逆转LR细胞的耐药性。这证明，降低的ROS水平是维持仑伐替尼耐药的关键因素。这一发现引导研究团队去探索ROS降低的机制。

通过RNA-seq的基因集富集分析（GSEA）发现，线粒体自噬通路在LR细胞中被显著激活。后续的Western Blot、共聚焦显微镜和TEM结果一致证实：LR细胞中，线粒体自噬关键蛋白（PINK1， Parkin， p62， LC3-II）表达上调，线粒体与自噬体的共定位增加，自噬体数量增多，而线粒体损伤减少。更重要的是，使用线粒体自噬抑制剂CQ处理，能显著增加LR细胞内的ROS水平，并恢复其对仑伐替尼的敏感性。这确立了“增强的线粒体自噬 → 清除受损线粒体 → 减少ROS产生 → 促进仑伐替尼耐药”的初步逻辑链条。

接下来，研究聚焦于调控这一过程的上游分子。RNA-seq和CRISPR-seq整合分析锁定linc01607在LR中高表达。临床样本和PDO模型验证了linc01607在仑伐替尼耐药患者中表达更高，且其表达水平与类器官的IC50值正相关。功能获得和功能缺失实验证明，过表达linc01607能诱导亲本细胞产生耐药，而敲低linc01607则能恢复LR细胞对仑伐替尼的敏感性。动物实验也得到一致结果，并显示linc01607的 manipulation 能相应改变肿瘤内的ROS水平。这确立了linc01607作为关键耐药基因的角色。

机制探索部分揭示了linc01607调控线粒体自噬的具体路径。作为ceRNA，linc01607通过“海绵”吸附作用竞争性结合miR-892b，解除了miR-892b对其靶基因p62 mRNA的抑制，从而上调p62蛋白表达。上调的p62作为线粒体自噬的接头蛋白，促进了保护性线粒体自噬的发生，最终导致ROS降低和耐药。这一“linc01607/miR-892b/p62/线粒体自噬”轴通过回复实验得到了充分验证：例如，在敲低linc01607的LR细胞中过表达p62，可以挽救因linc01607敲低导致的线粒体自噬减弱、ROS升高和耐药性逆转；而同时过表达miR-892b则可阻断p62过表达的挽救效应。

研究还发现了一个更深层次的调控环路。p62不仅能促进线粒体自噬，还能通过隔离并促进Keap1的降解，激活抗氧化转录因子Nrf2。激活的Nrf2转入细胞核，启动下游抗氧化基因（如GPX4， NQO1， HO-1）的表达，进一步增强细胞的抗氧化能力。更为巧妙的是，ChIP和荧光素酶报告基因实验证实，Nrf2能够直接结合到linc01607基因的启动子区，促进其转录。这就形成了一个强大的正反馈循环：linc01607上调 → p62增加 → Nrf2激活 → 抗氧化能力增强并进一步上调linc01607转录。这个循环一旦建立，便能够持续、强效地维持细胞的低ROS状态和耐药表型。

最后，研究的转化医学价值在体内和PDO模型中得到验证。在动物模型中，仑伐替尼单药对LR肿瘤效果有限，而联合敲低linc01607则能显著抑制肿瘤生长。在患者来源的类器官中，对于相对耐药的类器官，联合使用仑伐替尼和linc01607沉默策略，比任一单用策略都更能有效抑制类器官的生长和活力。这为临床联合靶向linc01607以克服仑伐替尼耐药提供了直接的 preclinical 证据。

本研究的结论是：发现了一条由lncRNA linc01607驱动的、通过调控线粒体自噬和抗氧化通路来维持ROS稳态，从而导致肝细胞癌对仑伐替尼耐药的新机制。具体而言，linc01607作为ceRNA吸附miR-892b，上调p62表达，进而一方面增强保护性线粒体自噬以清除ROS来源，另一方面通过p62-Keap1-Nrf2轴激活抗氧化程序。Nrf2反过来转录激活linc01607，形成正反馈循环，稳固耐药状态。靶向linc01607（如沉默其表达）能够有效逆转仑伐替尼耐药。

这项研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学上，它首次系统阐明了lncRNA linc01607在HCC仑伐替尼耐药中的核心作用，并将ceRNA机制、线粒体自噬、Nrf2抗氧化通路和正反馈转录调控有机地整合到一个统一的框架内，深化了对肿瘤耐药，特别是ROS稳态相关耐药机制的理解。在应用上，linc01607不仅可作为一个预测仑伐替尼疗效的潜在生物标志物，更是一个极具前景的治疗靶点。研究提出的“仑伐替尼联合靶向linc01607”的治疗策略，为克服临床仑伐替尼耐药提供了新的思路和实验依据。患者来源类器官模型的成功应用，也增强了研究发现的临床转化潜力。

本研究的亮点在于：第一，研究发现的创新性：首次揭示了linc01607/miR-892b/p62/Nrf2正反馈轴在仑伐替尼耐药中的核心作用，机制阐述全面且深入。第二，研究策略的系统性：从临床现象出发，通过多组学整合筛选关键分子，结合细胞、动物、类器官多层次模型进行功能验证和机制剖析，逻辑链条完整严谨。第三，技术方法的综合性：运用了包括CRISPR筛选、RAP-seq、ChIP、双荧光素酶报告系统、活体成像、电镜等多种前沿技术，为结论提供了多维度、强有力的证据。第四，临床转化的前瞻性：不仅停留在机制探索，还利用患者来源类器官这一更接近临床的模型验证了联合治疗策略的有效性，直接指向了未来的临床应用方向。第五，对氧化还原稳态的聚焦：紧扣ROS稳态这一肿瘤耐药的核心议题，为理解靶向药物耐药提供了新的视角。