本研究由Declan L. Turner、Hannah Baric、Rhiannon B. Werder等人完成，主要作者来自澳大利亚墨尔本默多克儿童研究所（Murdoch Children’s Research Institute）、墨尔本大学（University of Melbourne）以及诺和诺德基金会干细胞医学中心（Novo Nordisk Foundation Centre for Stem Cell Medicine）等机构。该论文发表于*JCI Insight*，2026年3月17日在线发表，文章编号为e203042，标题为“巨噬细胞在人iPSC来源的肺泡气液界面中协调抗病毒防御与上皮修复”。
一、研究背景与目的
肺泡是肺部进行气体交换的基本结构单位，长期暴露于吸入的病原体和环境颗粒物中。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages）和2型肺泡上皮细胞（type 2 alveolar epithelial cells, AT2s）是维持肺泡稳态的关键细胞类型。AT2细胞负责产生肺表面活性物质（surfactant）、调节免疫并作为上皮损伤后的干细胞参与修复；肺泡巨噬细胞则具有清除病原体、吞噬表面活性物质和促进组织修复的功能。二者的协调对于维持肺内环境稳定至关重要。然而，由于人体肺泡组织难以在活体状态下反复取样，加之小鼠模型与人之间存在物种差异，目前对于人肺泡中AT2与巨噬细胞互作在病毒感染和修复过程中的机制仍了解有限。
为弥补这一空白，研究者构建了一种基于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源的肺泡气液界面（air-liquid interface, ALI）共培养平台。该平台同时包含iPSC来源的AT2细胞（iAT2s）和iPSC来源的巨噬细胞（iMacs），能在体外重现肺泡上皮与巨噬细胞的关键相互作用。研究目的包括：探究共培养对iAT2和iMac成熟及功能的影响；利用呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）和甲型流感病毒感染模型，解析巨噬细胞在抗病毒免疫与上皮修复中的作用；并筛选涉及上皮修复的关键信号通路。
二、研究设计与主要实验流程
研究首先分别依照已发表的分化方案从iPSC分化获得iAT2s和iMacs。iAT2s经定型内胚层、前肠前体诱导和NKX2-1⁺肺祖细胞纯化等步骤获得，随后在Transwell上建立ALI培养；iMacs则通过拟胚体（embryoid body）阶段逐步诱导至巨噬细胞谱系。共培养在第4至7天ALI成熟后，将iMacs以约1:10比例加入iAT2顶端表面。该比例参考人肺中AT2与肺泡巨噬细胞的大致数量关系。
在平台验证阶段，研究者通过流式细胞术、共聚焦成像和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）等手段确认共培养中两类细胞保持原有身份标志物；iAT2s持续表达SFTPC-tdTomato和NKX2-1-GFP，iMacs保持CD45⁺CD14⁺。进一步实验显示，共培养显著提高跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER），表明上皮屏障功能增强。同时，iMacs在共培养中CD86表达上调，提示其被iAT2来源的信号激活。
为了明确iAT2s对iMacs的支持机制，研究者检测了iAT2条件培养基中巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平，发现iAT2s在ALI中分泌较高水平的M-CSF。通过中和抗体实验阻断M-CSF可抑制iMacs表面HLA-DR表达上调，证明iAT2s主要依靠M-CSF维持共培养中巨噬细胞的活化状态。
在病毒感染实验中，研究者使用RSV A2株和甲型流感病毒PR8株进行顶端感染。利用scRNA-seq分析感染后48小时的细胞转录组变化，并通过定量PCR、ELISA和空斑实验评估病毒载量和抗病毒基因表达。为解析上皮修复相关信号，研究者还建立了划痕损伤模型，并结合CellChat配体-受体分析软件鉴定感染过程中新出现的细胞通讯通路。
三、主要结果
在稳态条件下，共培养促进了iAT2s中与表面活性物质合成和脂质代谢相关的基因表达。scRNA-seq聚类分析发现，共培养后的iAT2s高表达SFTPB、ABCA3和PGC等AT2成熟相关基因；基因集富集分析显示脂质合成、糖基化和ATP结合盒转运体通路显著增强。功能实验进一步证实，iMacs能够快速吞噬由iAT2s分泌的荧光标记脂质，并且该吞噬可被细胞松弛素D抑制，说明iMacs在共培养体系中执行了类似体内肺泡巨噬细胞的表面活性物质清除功能。
在免疫表型方面，共培养后的iMacs经SingleR-like算法（sctype）鉴定与体内原代人肺泡巨噬细胞更相似，而单独培养的iMacs更倾向于普通肺免疫细胞类型。iMacs在共培养环境中CD206和CD169等肺泡巨噬细胞标志物维持表达，同时未出现明显的细胞周期进入，表明其处于相对稳定状态。
在RSV感染实验中，iMacs是主要的病毒转录本携带细胞，但RSV在iMacs中呈流产性感染状态，不产生大量子代病毒。相比之下，iAT2s虽可被感染并持续释放感染性病毒长达11天，但共培养体系中病毒释放量显著低于iAT2单独培养。scRNA-seq数据显示，共培养的iAT2s旁观者细胞中干扰素刺激基因（ISGs）如IFITM1和MX1表达升高，干扰素信号通路显著富集；iMacs则在感染后产生大量I型干扰素（IFN-β）和促炎细胞因子（如TNF、IL-6、CCL2），进一步强化了局部抗病毒环境。这些结果说明，巨噬细胞通过自身抗病毒活性和诱导上皮细胞抗病毒状态两方面限制了病毒复制。
在上皮修复方面，划痕实验中iMacs显著加快了iAT2单层的损伤闭合速度。然而，RSV感染早期（感染后第2天），存在iMacs的共培养组TEER下降更明显，提示巨噬细胞在某些炎症条件下可能增加上皮通透性。通过CellChat分析感染后新出现的配体-受体对，研究者发现VEGFA-VEGFR2信号是感染后iAT2s向iMacs传递的主要新增通路。iAT2s在感染后高表达VEGFA，而共培养iMacs上调KDR（VEGFR2）表达。使用VEGFR2抑制剂semaxanib处理可完全阻断共培养中RSV导致的上皮通透性增加，而对单独iAT2培养无显著影响，表明该信号轴在病毒感染早期参与调节上皮屏障完整性。
四、结论与意义
该研究成功建立了基于人iPSC的AT2-巨噬细胞ALI共培养平台，在体外重现了肺泡上皮与巨噬细胞在稳态、病毒感染和损伤修复中的关键互作。平台保留了两种细胞的谱系身份，并可通过iAT2来源的M-CSF维持巨噬细胞功能。更为重要的是，该模型首次在体外证实人iAT2来源的VEGFA可通过VEGFR2作用于巨噬细胞，调节病毒感染早期的上皮通透性。
从科学价值看，该工作拓展了对人肺泡AT2-巨噬细胞相互作用的理解，特别是在抗病毒天然免疫和上皮屏障调控方面。由于RSV等人类限制性病原体在常规小鼠模型中难以有效复制，该平台为研究人呼吸道病毒感染早期机制提供了独特工具。从应用价值看，该共培养体系有望用于高通量药物筛选、抗病毒药物开发以及慢性肺部疾病（如肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征）的机制研究和治疗靶点鉴定。
五、研究亮点
本研究的突出之处在于：第一，将iPSC来源的AT2和巨噬细胞共培养于ALI环境中，使细胞在形态和功能上更接近体内状态；第二，结合scRNA-seq和配体-受体分析，系统解析了感染前后AT2与巨噬细胞间的通讯网络；第三，首次报道了人AT2来源VEGFA通过巨噬细胞VEGFR2参与病毒感染时上皮通透性改变；第四，利用可扩展的iPSC平台，使研究不受原代肺组织来源限制，满足多种实验通量需求。
六、其他有价值的内容
研究者还比较了原始造血来源和定向造血来源的iMacs，发现二者均可成功建立共培养并在RSV感染中上调ISGs，说明该平台不依赖于特定巨噬细胞分化途径。此外，该研究的数据已存入NCBI GEO数据库，登录号为GSE294640，可供其他研究者获取和分析。这些内容为后续开发和优化更复杂的多细胞肺泡模型提供了基础。