白桦脂酸对寨卡病毒感染神经祖细胞发挥细胞保护作用

主要作者及机构

本篇研究论文的主要通讯作者为Milena B. P. Soares，来自巴西萨尔瓦多的Gonçalo Moniz研究所（Oswaldo Cruz Foundation, FIOCRUZ）。第一作者为Bruno R. R. Cavalcante，其所属机构包括São Rafael医院生物技术与细胞治疗中心、D’Or研究与教育研究所（IDOR）以及Gonçalo Moniz研究所。其他重要合作机构包括巴西巴伊亚联邦大学健康科学研究所和巴西帕拉伊巴联邦大学药学系。该研究于2020年5月2日投稿至Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2020年10月13日被接收，并于2020年11月5日正式发表。

学术背景

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种正义单链RNA虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属。该病毒因导致格林-巴利综合征和新生儿小头畸形而受到全球关注。神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）具有多向分化潜能，可分化为主要的神经细胞表型，对寨卡病毒感染高度易感。研究表明，寨卡病毒感染NPCs后会引起细胞周期相关蛋白表达异常、诱导细胞凋亡（apoptosis），并损害新生神经元的产生。在体外三维培养模型中，寨卡病毒感染人神经球可抑制其生长并导致细胞死亡增加。

目前尚无获批的疫苗或特异性疗法用于预防或治疗寨卡病毒感染，因此迫切需要开发有效的抗病毒药物。天然产物在药物发现中具有重要作用，其中萜类化合物（terpenoids）因其结构多样性而备受关注。白桦脂酸（betulinic acid, BA）是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，广泛存在于植物界中，具有神经保护作用。本研究旨在评估BA在人神经祖细胞中对寨卡病毒的抗病毒活性和神经保护作用，分别在二维和三维培养体系中进行验证。

研究流程与实验方法

本研究首先从Ziziphus joazeiro根部重新分离获得BA，纯度≥98%。将冻干化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并在细胞培养基中稀释至终浓度低于0.1%。人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）通过附加体载体重编程皮肤成纤维细胞获得，经伦理委员会批准。寨卡病毒株（GenBank KU940228）从患者血清中分离，并在C6/36细胞中维持培养。病毒滴度通过Vero细胞进行测定，按照Reed和Muench方法计算，获得滴度为10⁶ TCID50/ml。

神经诱导在Matrigel包被的平板中进行，使用StemDiff神经诱导培养基将iPSCs分化为NPCs。神经花环通过StemDiff神经花环选择试剂进行分离，NPCs维持在StemDiff神经祖细胞培养基中。神经元分化则在多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的24孔板中进行，使用StemDiff神经元分化培养基培养7天，随后使用StemDiff神经元成熟培养基继续培养4周。寨卡病毒感染在96孔板（10⁴细胞/孔）或6孔板（2.5×10⁵细胞/孔）中进行，感染复数（multiplicity of infection, MOI）为1。病毒吸附和穿入90分钟后，加入神经祖细胞培养基继续培养48小时，同时加入不同浓度的BA（6.25、12.5、25和50 µM）进行药理学处理。

脑类器官（cerebral organoids）的生成按照Lancaster和Knoblich的方法并稍作修改。在第0天，将9,000个iPSCs接种于低吸附U形底96孔板中形成拟胚体（embryoid bodies, EBs），使用含20% Knockout血清替代物、4 ng/ml bFGF和10 µM ROCK抑制剂的DMEM/F12培养基。第6天将EBs转移至含神经培养基的培养皿中，第11天将类器官包埋于Matrigel液滴中并在1:1 DMEM/F12:Neurobasal培养基中培养。第15天将类器官转移至搅拌式生物反应器中进行长期培养。对于6周龄的类器官（约150,000个细胞/类器官），以MOI为1接种寨卡病毒，孵育1小时后加入含10 µM BA的新鲜培养基，每2-3天换液，持续7天。

抗病毒活性评估通过测定半数抑制浓度（IC50）和半数细胞毒性浓度（CC50）进行。细胞毒性用AlamarBlue法检测。神经保护活性的半数有效浓度（EC50）通过Operetta高内涵筛选系统（high content screening system）进行分析，使用Harmony 3.5.2软件进行图像分割和细胞识别，每个孔拍摄9个视野。细胞靶向通过Harmony数字相位成像算法实现。Western blot分析用于检测Akt信号通路蛋白表达，使用抗总Akt抗体和抗磷酸化Akt（S473）抗体。免疫荧光分析在共聚焦显微镜下进行，使用抗cleaved caspase-3、DCX、nestin、SOX2、黄病毒E蛋白等抗体。基因表达分析采用TaqMan探针实时定量PCR，以GUSB、HPRT和GAPDH作为内参基因。caspase酶活性通过Caspase-Glo检测试剂盒检测。生物信息学分析使用STITCH数据库（版本5.0）鉴定与BA相关的靶基因，置信度评分>0.7。所有统计分析使用GraphPad Prism 8软件进行，采用非线性回归、单因素方差分析、双因素方差分析和非配对Student’s t检验。

主要研究结果

研究首先对NPCs和神经元进行表征。免疫荧光显示NPCs表达nestin和SOX2，高内涵分析显示nestin⁺细胞占99.78%±0.2%，SOX2⁺细胞占77%±11%，PAX6⁺细胞占59.41%±10%。基因表达分析显示NPCs表达DCX和SOX2，而神经元中MAP2和TUJ1表达更高。这些结果证实了NPCs和神经元的分化状态。

寨卡病毒感染比较实验显示，感染48小时后，NPCs中寨卡病毒阳性细胞比例显著高于神经元。Axl受体基因表达分析显示NPCs中Axl表达显著高于神经元。NPCs细胞密度在寨卡病毒感染后明显下降。caspase 3酶活性在感染后48小时显著升高，证实NPCs通过凋亡途径发生细胞死亡。

在BA效果评估中，BA对未感染NPCs的CC50>50 µM，显示低毒性。在寨卡病毒感染的NPCs培养中，BA呈现浓度依赖性抗病毒活性，IC50为20.30±1.50 µM。最高浓度（50 µM）几乎达到100%的病毒抑制效果。然而，50 µM BA处理的培养中NPCs数量显著减少。与之相反，12.5 µM BA虽然抗病毒活性较弱，但维持了感染后存留细胞数量与模拟感染组相似。cleaved caspase-3表达分析显示，12.5 µM BA处理组CASP3⁺ NPCs数量减少，而25 µM以上浓度则导致cleaved caspase-3增加和细胞活力降低。caspase 3酶活性检测也呈现相同趋势。这些数据表明12.5 µM BA通过抑制凋亡保护NPCs免受寨卡病毒诱导的细胞死亡。

在脑类器官实验中，寨卡病毒感染的类器官呈现SOX2⁺ NPCs面积显著减少和CASP3⁺细胞增加。BA处理组SOX2⁺ NPCs面积增加，CASP3⁺细胞减少。寨卡病毒感染导致类器官形态结构明显异常，包括边界不规则、空腔形成、脑室区样结构破坏以及外层DCX⁺细胞减少。BA处理的类器官结构保存更为完好。

STITCH数据库分析鉴定出与BA相关的基因包括CASP3、AKT1、BIRC5、TOP1、TOP2A、NOS3、SP1、PNLIP、LMNB1和CYCS。这些靶标主要与凋亡调节、细胞增殖和有丝分裂细胞周期相关。选择Akt通路进行验证，Western blot分析显示BA处理组磷酸化Akt（p-Akt）水平在寨卡病毒感染培养中显著升高，而总Akt水平无变化。免疫荧光分析也证实BA处理的寨卡病毒感染脑类器官中磷酸化Akt表达增加。

结论与意义

本研究首次证明BA对寨卡病毒感染的NPCs具有神经保护作用。BA在较低浓度（12.5 µM）下通过不依赖抗病毒活性的方式保护NPCs免受寨卡病毒诱导的细胞死亡。在脑类器官模型中，BA处理能够维持SOX2⁺ NPCs群体并减少凋亡细胞，同时保持类器官结构完整性。机制研究表明BA通过激活Akt信号通路发挥神经保护作用。这一发现为寨卡病毒感染的治疗干预提供了新的药物候选策略。

本研究的科学价值在于：首先，建立了基于人NPCs的高内涵药物筛选平台，可同时评估候选药物的抗病毒活性和神经毒性；其次，揭示了BA的双重效应——高浓度下具有抗病毒活性但伴随细胞毒性，低浓度下则以神经保护为主；第三，在三维脑类器官模型中验证了BA的保护作用，增强了结果的临床相关性。在应用价值方面，BA作为一种能够穿越血脑屏障的天然化合物，为寨卡病毒相关神经系统并发症的治疗提供了潜在候选药物。此外，该研究还提示BA结构修饰或与其他抗病毒药物联合使用可能进一步提升治疗效果。

研究亮点

本研究的主要亮点包括：（1）系统比较了NPCs和神经元对寨卡病毒的易感性差异，并将其与Axl受体表达差异相关联；（2）利用高内涵筛选系统建立了可同时评估抗病毒活性和细胞保护作用的药物筛选流程；（3）在二维和三维培养体系中均验证了BA的神经保护作用，增强了结论的可信度；（4）通过生物信息学分析和实验验证揭示了Akt信号通路在BA神经保护机制中的关键作用；（5）发现BA的作用具有浓度依赖性的双重效应，这一发现对后续剂量优化和药物开发具有重要指导意义。