本研究由挪威科技大学公共卫生与护理系的Abhibhav Sharma和Guro F. Giskeødegård等人主导，联合奥斯陆乳腺癌联盟（OSBREAC）共同完成。论文于2024年发表在《Oncogenesis》期刊上。该研究旨在通过整合多组学数据，揭示具有不同长期预后的乳腺癌亚型，以克服传统内在亚型在长期生存预测上的局限性。
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，其高度异质性导致了患者在相似诊断下对治疗的反应和预后存在显著差异。目前，临床上广泛应用基于基因表达谱的PAM50内在分子亚型（intrinsic subtypes）来对乳腺癌进行分类，包括基底样型（basal-like）、人表皮生长因子受体2富集型（HER2 enriched）、管腔A型（Luminal A）、管腔B型（Luminal B）和正常型（normal-like）。尽管这些亚型与临床结局有显著关联，但多项研究表明，它们在超过5年，特别是10年以上的长期生存预测中，其表现常与预期临床结果产生偏差。例如，有研究发现管腔B型在10年后的预后甚至比基底样型更差。这一局限性促使研究者寻求更全面的生物学表征方法，以提高对患者长期预后的评估能力。
该研究的核心目标是利用整合多组学分析，识别乳腺癌自然形成的、具有显著不同长期生存率的预后亚组，并验证其在外部队列中的稳健性。研究假设，整合转录组、蛋白质组和代谢组数据能够提供比单一mRNA表达层面更全面的肿瘤分子特征，从而更准确地反映肿瘤的生物学行为。
为实现这一目标，研究团队设计了一个系统性的研究框架。首先，他们使用了来自Oslo2研究的发现队列（discovery cohort），该队列包含335名未经术前辅助治疗的乳腺癌患者的新鲜冰冻肿瘤组织样本，并拥有超过12年的长期随访数据。对这些样本，研究者分别进行了高通量分子检测：利用Agilent微阵列芯片获得了转录组（transcriptomic）数据，覆盖21851个基因；采用反相蛋白阵列技术（Reverse Phase Protein Array, RPPA）检测了151种肿瘤相关蛋白的表达，获得了蛋白质组（proteomic）数据；并使用高分辨率魔角旋转磁共振波谱技术（High-Resolution Magic Angle Spinning Magnetic Resonance Spectroscopy, HR-MAS MR）定量分析了18种代谢物，获得了代谢组（metabolomic）数据。
随后，研究团队采用了一种名为多组学因子分析（Multi-Omics Factor Analysis +, MOFA+）的无监督集成方法。他们对比了包含不同数量潜在因子（latent factors）的MOFA+模型，最终选择了包含20个潜在因子的最优模型，该模型在平均方差膨胀因子（VIF）和解释的总方差之间取得了良好平衡。MOFA+模型将这三种组学数据降维，识别出解释数据变异性的主要潜在因子，这些因子是跨组学的共同低维表示。
接着，研究者进行了生存分析和聚类分析。通过构建多变量Cox比例风险回归模型，他们评估了20个多组学因子（MOFs）与乳腺癌特异性死亡和/或转移的关联，发现因子1、因子2和因子13与长期生存显著相关。基于这三个生存相关因子，研究者使用K-means聚类算法将Oslo2队列的患者分为三个不同的多组学亚群（multi-omics clusters, MOCs），分别命名为MOC1、MOC2和MOC3。这三个亚群的患者在长期（长达15年）总体生存率和乳腺癌特异性生存率上均表现出显著差异（log-rank检验 p=0.005）。具体而言，MOC1预后最好，MOC2预后最差，而MOC3居中。值得注意的是，在研究传统PAM50内在亚型的长期预后时，确实观察到了与预期临床模式不符的异常结果，例如在长期随访中基底样亚型患者显示出相对较好的预后，而管腔型患者生存率较差。这一现象也在TCGA和METABRIC两个大型验证队列中得到了验证，显示出内在亚型在超长期生存预测上的局限性，从而凸显了建立新分类方法的必要性。
为了验证新发现亚群的普适性，研究者在两个独立的大型公共队列——癌症基因组图谱（TCGA）和乳腺癌国际联盟分子分类学（METABRIC）队列中进行了验证。由于验证队列缺少完整的组学数据（如METABRIC仅有转录组数据），他们设计了一个基于监督式机器学习的验证框架。首先，针对Oslo2队列的MOCs，进行显著性微阵列分析（SAM）以识别两两比较间的差异表达基因。然后，以Oslo2队列中与验证队列共有的组学特征为输入，训练了一个由随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）三个分类器组成的集成模型，用以预测MOC分类。该模型经过5折交叉验证优化超参数后，被应用于TCGA和METABRIC队列的样本分类。结果显示，在两个验证队列中，三个MOC亚群的长期生存曲线分离趋势与发现队列高度一致，MOC2始终表现出最差的预后，且各亚群中的PAM50分子亚型分布和临床特征也具有连贯性，有力地证明了该分型的稳健性。
为了揭示不同预后亚群背后的分子机制，研究团队进行了系统的功能分析。他们主要关注预后差异最大的MOC1和MOC2。通过基因集富集分析（GSEA）发现，MOC1中上调的基因集主要富集在与免疫系统相关的通路上，如细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。而MOC2中则上调了与RAF1等相关的致癌信号通路。更重要的是，研究者整合了差异表达的转录组、蛋白质组和代谢组特征，构建了多组学网络，并进行了多组学通路分析。该分析揭示了MOC1和MOC2在谷氨酰胺（glutamine, Gln）和谷氨酸（glutamate, Glu）代谢通路上的显著差异。MOC1的特征是高水平的谷氨酸和低水平的谷氨酰胺，以及谷氨酰胺酶（GLS）基因的显著上调，这表明MOC1肿瘤具有高度活跃的谷氨酰胺分解（glutaminolysis）过程。相反，MOC2表现为高水平的谷氨酰胺和低水平的谷氨酸。进一步的蛋白质组特征分析显示，MOC2高表达细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、CDK2和细胞周期蛋白D等蛋白，同时其PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因（PIK3家族）上调，多组学通路分析也富集到了内分泌抵抗通路。这解释了MOC2更具侵袭性的生物学基础和不良预后。此外，MOC3的特征是牛磺酸和肌醇水平显著升高，二者均与促进细胞凋亡有关，同时GSEA分析也发现MOC3的有丝分裂细胞周期通路显著下调，这可能是其预后好于MOC2的原因。
本研究的主要结论是，对乳腺癌进行代谢组、转录组和蛋白质组的整合分析，能够有效地区分高度侵袭性和低度侵袭性的乳腺癌类型。研究发现并验证了三个具有独特临床和生物学特征的长期预后亚群，这些新亚群与长期生存的关联性强于传统的PAM50内在亚型。通过系统生物学分析，研究揭示了不同亚群的特征性通路和潜在驱动因素，例如MOC1与MOC2之间在谷氨酰胺代谢和PI3K/AKT/mTOR信号通路上的显著差异，为理解乳腺癌异质性背后的生物学机制提供了更深层次的分子见解。
这项研究的科学价值在于，它证明了多组学整合方法在精准肿瘤学中的巨大潜力，超越了单一组学方法的局限，为乳腺癌的预后评估提供了更精确、更稳定的分子分型策略。其应用价值在于，尽管临床上常规获取全部组学数据存在挑战，但研究证明，通过在大规模队列上训练的鲁棒监督模型，仅使用有限的组学特征（如转录组）即可实现对多组学亚群的准确分类，这为其临床转化提供了可行的路径。研究的一个显著亮点是利用发现队列建立的分类器在两个独立验证队列中展现出了卓越的稳健性和一致性，证明了该分型并非数据本身固有的批次效应。此外，研究中观察到的传统内在亚型在长期随访中预后模式的反常现象，以及新分型对其的纠正，是该领域的一个重要发现，挑战了固有的临床认知。研究也坦率地讨论了其局限性，如长期随访期间治疗策略的变化对预后判断可能产生的影响，这一点在解读METABRIC等历史较久远的队列结果时尤为重要。