关于非小细胞肺癌单细胞与空间转录组学分析的研究报告

由Marco de Zuani, Haoliang Xue, Jun Sung Park等共同主导的研究团队，在《自然·通讯》（Nature Communications）期刊于2024年发表了题为“非小细胞肺癌的单细胞与空间转录组学分析”的研究论文。该研究团队由来自英国韦尔科姆桑格研究所、欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）、剑桥大学、德国癌症研究中心等多个国际顶尖机构的科学家组成。

本研究属于肿瘤生物学和免疫学的前沿交叉领域，尤其聚焦于肿瘤微环境（TME）的高分辨率解析。肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占绝大多数。尽管免疫疗法（如PD-1/PD-L1抑制剂）已取得突破，但患者反应率差异巨大，提示我们对肿瘤免疫微环境的复杂性和异质性理解仍不充分。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME中最丰富的免疫细胞之一，已知在促进肿瘤生长、免疫抑制和血管生成中发挥关键作用，但其在NSCLC中的具体状态、空间分布、功能及其与患者亚型的关联尚缺乏系统性描绘。传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽能揭示细胞类型与状态，但丢失了空间位置信息。因此，本研究旨在通过整合大规模单细胞测序与空间转录组学技术，为NSCLC构建一个高精度的分子与空间图谱，重点解析TAMs的异质性、功能状态及其在肿瘤微环境重塑中的作用，以期为开发更有效的肺癌治疗策略提供新见解。

详细研究流程 本研究设计严谨，整合了多种前沿技术，主要包含以下步骤：

1. 样本采集与处理： 研究团队从25名未经治疗的NSCLC患者（13例肺腺癌（LUAD），8例肺鳞状细胞癌（LUSC），4例未定型）的手术切除组织中，收集了肿瘤组织及相匹配的邻近非肿瘤（背景）组织，并获取了2名健康捐赠者的肺组织。这种配对样本设计对鉴别肿瘤特异性变化至关重要。所有组织在处理当天被机械切割并用胶原酶IV和DNase I消化成单细胞悬液。细胞经过死细胞去除和CD235a（去除红细胞）或CD45+（富集免疫细胞）的分选策略，以分别获得包括免疫和非免疫细胞的全面视图。最终，总计约90万个高质量细胞被保留用于后续分析。

2. 单细胞RNA测序与数据分析： 使用10x Genomics Chromium平台对单细胞悬液进行3‘ scRNA-seq。数据分析采用了标准且严谨的生物信息学流程。首先进行质量控制，过滤低质量细胞和潜在的双细胞（使用Scrublet算法）。为了准确识别样本间真实的生物学差异而非技术批次效应，研究团队创造性地将肿瘤样本与背景/健康样本的数据集分开进行后续分析：分别进行高度可变基因选择、主成分分析（PCA）、批次校正（使用Harmony算法）、基于图的分群（Leiden算法）和细胞类型注释。通过差异表达基因和已知的标志物，他们共注释出髓系细胞（单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）、肥大细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞、B细胞以及多种非免疫细胞（如肺泡II型细胞（AT2）、成纤维细胞、淋巴管内皮细胞等）。特别地，他们识别出一个同时表达髓系基因（如LYZ, CD68）和上皮基因（如KRT19, EPCAM）的特殊细胞群，称为癌症相关巨噬细胞样细胞（CAMLs）。这种分开注释再通过参考-查询映射（使用scArches算法）验证一致性的策略，增强了细胞注释的鲁棒性。

3. 空间转录组学与整合分析： 为了将细胞类型定位回组织空间，研究团队从上述25名患者中的8名，获取了其肿瘤和背景组织的新鲜冷冻切片，使用10x Genomics Visium空间转录组学平台进行了分析（总计36张切片）。然后，他们运用先进的细胞类型反卷积工具cell2location，利用scRNA-seq数据集中定义的细胞类型特异性表达谱，来估算Visium每个捕获点中各种细胞类型的丰度。这一步骤是将单细胞分辨率与空间背景联系起来的核心。

4. 细胞间相互作用推断： 为了探究不同细胞类型如何在TME中通讯，研究使用CellPhoneDB软件包，基于scRNA-seq数据中配体-受体（L-R）的共表达模式，推断统计上显著的细胞间相互作用对。他们重点比较了LUAD和LUSC之间，以及肿瘤组织与背景组织之间互作网络的差异。

5. 肿瘤细胞与特殊细胞群鉴定： 为了区分恶性上皮细胞与正常上皮细胞，研究应用了copyKAT算法。该算法通过分析scRNA-seq数据中相邻基因的表达水平来推断基因组范围的拷贝数变异（CNAs），具有广泛CNA的细胞被判定为肿瘤细胞。此方法被用于验证AT2细胞群的肿瘤属性，并意外地发现CAMLs也携带与同患者肿瘤细胞高度相似的CNAs。

6. 巨噬细胞功能与发育轨迹分析： 对巨噬细胞亚群进行了深入的差异表达分析（DEA），以揭示其在肿瘤中的功能重编程。使用伪批量（pseudo-bulk）方法（通过py_deseq2）比较肿瘤与背景中巨噬细胞的基因表达谱。此外，采用PAGA（Partition-based Graph Abstraction）轨迹推断算法，探索了髓系细胞和非免疫细胞在肿瘤内的分化或状态转换关系。为了探究肿瘤巨噬细胞是否具有胚胎特征，研究团队将自身数据与已发表的人类胎儿肺scRNA-seq数据集以及一个涵盖多种组织的人类单核/巨噬细胞图谱（MOMAC-verse）进行整合与比较。

7. 实验验证： 部分关键发现通过实验进行了验证。例如，使用免疫组化（IHC）在组织切片上验证了STAB1+巨噬细胞在肿瘤中的存在及与上皮细胞的接近；使用BODIPY™ 493/503染色证实了肿瘤组织中中性脂质（包括胆固醇）的积累增加。

主要研究结果 研究取得了多层次、系统性的发现，各结果间逻辑连贯，逐步深入：

1. 肿瘤微环境的细胞组成图谱： 分析揭示了肿瘤与背景组织在细胞组成上的显著差异。与背景组织相比，肿瘤组织中单核细胞和未成熟髓系细胞比例减少，而树突状细胞（DCs）、B细胞以及抗炎巨噬细胞（AIMɸ）比例增加。特别值得注意的是，肿瘤内的NK细胞表现出细胞毒性降低的表型，而T细胞中调节性T细胞（Tregs）富集，细胞毒性T细胞耗竭。相关性分析显示，AIMɸ（尤其是STAB1+ Mɸ）的丰度与NK/T细胞的丰度呈强烈负相关，提示巨噬细胞在抑制效应免疫细胞浸润中起核心作用。

2. LUAD与LUSC的共性与特性： 尽管LUAD和LUSC在临床和分子层面不同，但scRNA-seq分析显示两者的整体细胞类型组成非常相似。然而，CellPhoneDB分析揭示了关键的差异：两者采用了不同的细胞间相互作用网络。特别是在免疫检查点分子（ICIs）的共表达上存在显著区别：LUAD中更常发现LGALS9-HAVCR2（TIM3通路）和NECTIN2-TIGIT等相互作用，而LUSC中则偏好CD96-NECTIN1相互作用。经典的PD1-PDL1相互作用在两种亚型的分析中均未检测到显著性。这些发现暗示了针对不同NSCLC亚型可能需要进行差异化的免疫治疗靶点选择。

3. 空间定位验证关键互作： cell2location分析成功在空间上解析了不同细胞类型的位置，结果与scRNA-seq的丰度变化趋势总体一致（尽管存在因技术偏差导致的某些比例差异）。更重要的是，空间分析确认了多个由CellPhoneDB预测的肿瘤特异性L-R对在组织原位确实显著共定位，如NRP1-VEGFA（血管生成）、NECTIN2-TIGIT和CD96-NECTIN1（免疫抑制）等，而PD1-PDL1在空间上也未显示显著共定位。这为上述互作推断提供了强有力的原位证据。

4. 癌症相关巨噬细胞样细胞（CAMLs）的鉴定与特征： 这是一个重要发现。该细胞群在转录组上兼具髓系和上皮特征，双细胞检测评分低，且copyKAT分析惊人地显示它们携带与同患者肿瘤细胞几乎完全相同的拷贝数变异（CNA）谱。KL散度分析证实了CAMLs的CNA分布与肿瘤细胞的相似度极高。空间共定位分析和非负矩阵分解（NMF）进一步显示CAMLs与肿瘤细胞（AT2）在物理位置上紧密相邻。PAGA轨迹分析提示CAMLs可能源自STAB1+ Mɸ。这些证据强烈支持CAMLs并非技术假象，而极有可能是与肿瘤细胞发生紧密相互作用（如吞噬、融合或紧密黏附）的巨噬细胞。此前CAMLs多在患者外周血中被报道与转移相关，本研究首次在肿瘤原发灶中系统性地从多组学角度鉴定了它们。

5. 肿瘤相关巨噬细胞的功能重编程： 差异表达分析发现，肿瘤中的肺泡巨噬细胞（AMɸ）和AIMɸ均上调了与胆固醇和脂质转运代谢相关的基因（如ABCA1, APOE），提示其向胆固醇“输出”状态转变，以支持肿瘤细胞快速增殖对膜脂的旺盛需求。BODIPY染色证实肿瘤区域中性脂质沉积增加。更具特色的是，肿瘤中特有的STAB1+ Mɸ亚群表达一套独特的“STAB1特征基因”，其中包括编码唯一已知铁输出蛋白的铁转运蛋白（SLC40A1）。同时，它们下调铁存储蛋白（如FTH1, FTL）。这表明STAB1+ Mɸ可能通过促进铁外流，为高增殖的肿瘤细胞提供必需的铁元素，从而支持肿瘤生长。

6. 巨噬细胞的“癌胚重编程”： 通过整合人类胎儿肺单细胞数据，研究发现肿瘤中的STAB1+ Mɸ在转录谱上与胎儿肺中占主导的SPP1+巨噬细胞高度相似，都高表达STAB1、FOLR2、SLC40A1等特征基因。这一相似性在更广泛的MOMAC-verse数据集中也得到了印证，其中与STAB1+ Mɸ特征最匹配的是被描述为具有“胎儿样”转录特征的HES1+常驻样巨噬细胞。这表明，肿瘤微环境诱导巨噬细胞发生了“癌胚重编程”，使其获得了一种类似于胚胎发育支持组织的促生长表型。

研究结论与价值 本研究的核心结论是：通过整合单细胞与空间多组学，成功绘制了NSCLC肿瘤微环境的高分辨率分子与空间图谱，系统揭示了其复杂的细胞组成、互作网络和功能状态。研究不仅证实了TAMs在抑制抗肿瘤免疫中的核心作用，更深化了对其功能异质性的理解，特别是发现了：1）LUAD与LUSC虽细胞组成相似，但利用了不同的免疫检查点互作网络，提示了亚型特异性免疫治疗靶点；2）存在一种与肿瘤细胞遗传学特征相同、空间上紧密相邻的特殊巨噬细胞群CAMLs；3）肿瘤相关巨噬细胞，尤其是STAB1+亚群，经历了显著的功能重编程，转向支持肿瘤生长的胆固醇和铁代谢模式，并获得了类似于胎儿巨噬细胞的转录特征，即“癌胚重编程”。

本研究的科学价值在于，它提供了迄今为止对NSCLC肿瘤微环境最全面、最整合的分析之一，将细胞类型、状态、空间位置、细胞间通讯和功能重编程等多个维度有机结合，为肿瘤免疫学领域提供了宝贵的资源数据集和新的生物学见解。其应用价值在于，所鉴定的差异化免疫检查点（如TIGIT、TIM3、CD96）为开发针对不同NSCLC亚型的下一代免疫疗法提供了潜在靶点；对巨噬细胞胆固醇/铁代谢重编程和癌胚特征的揭示，为通过代谢干预或靶向肿瘤相关巨噬细胞来克服免疫治疗耐药性开辟了新的思路。

研究亮点 1. 技术与规模创新： 整合了来自25名初治患者配对标本的近90万个细胞的scRNA-seq和8名患者的空间转录组学，规模大、设计严谨，并创新性地采用分数据集分析策略以保留真实生物学差异。 2. 系统性发现： 超越单纯的细胞分类，系统阐述了从细胞组成、空间架构、细胞互作到关键细胞亚群（CAMLs, STAB1+ Mɸ）的分子特征与功能的完整故事线。 3. 关键新发现： 首次在原发肿瘤中通过多组学证据（转录组、CNA、空间共定位）强力证实了CAMLs的存在与特性；明确提出并验证了肿瘤巨噬细胞存在向“癌胚”表型重编程的现象，并与其独特的促肿瘤代谢功能（胆固醇和铁输出）相联系。 4. 临床转化启示： 明确了LUAD与LUSC在免疫检查点互作网络上的差异，为精准免疫治疗提供了直接的理论依据。

这项研究是肿瘤微环境研究领域的一项标志性工作，其产生的丰富数据和深刻见解将持续推动对肺癌生物学本质的理解和新型治疗策略的开发。