学术报告：携带BRAF^V600E突变的甲状腺乳头状癌类器官揭示BRAF抑制剂联合治疗的潜在获益
一、研究概况
本研究由Dong Chen、Xi Su、Lizhang Zhu等学者共同完成，主要研究机构包括北京大学深圳医院甲状腺乳腺外科与核医学科，通讯作者为Peng Li、Wei Wei与Yongsheng Zhao。该研究于2023年发表于 *Journal of Translational Medicine*（doi: 10.1186/s12967-022-03848-z），属于单中心、前瞻性的转化医学研究。
二、研究背景与目的
甲状腺癌已成为最常见的内分泌恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer, PTC）占80%–85%。PTC整体预后良好，但约20%的患者会出现区域复发或远处转移，且超过一半的转移性患者对常规治疗（如促甲状腺激素抑制治疗与放射性碘治疗）不再应答。BRAF^V600E是PTC中最常见的驱动突变，可导致下游MEK（mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase）与ERK（extracellular signal-regulated kinase）持续磷酸化，促进恶性转化。尽管BRAF抑制剂已在携带BRAF^V600E的恶性黑色素瘤中取得显著疗效，但在PTC中的单药疗效有限，且缺乏能够预测个体患者药物反应的临床前模型。
传统的体外PTC细胞系与亲代肿瘤在组织结构和突变谱上差异较大，患者来源异种移植模型（patient-derived xenograft, PDX）则需要大量标本和4–8个月建立周期。患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）可在1个月内高效扩增，并能更好地保留亲代肿瘤的病理与遗传特征。既往已有类器官用于结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤的研究，但在PTC中报道较少。本研究旨在建立BRAF^V600E突变型与野生型PTC类器官模型，评估其对BRAF抑制剂单药及联合治疗的反应，以期为临床个体化用药提供临床前依据。
三、研究流程与方法
1. 样本收集与类器官建立。 研究在2021年8月至2022年6月期间于北京大学深圳医院收集手术切除的PTC组织。共纳入9例患者（PTC-1至PTC-9），其中5例携带BRAF^V600E突变（PTC-1至PTC-5），4例为BRAF野生型（PTC-6至PTC-9）。组织经机械剪碎后，以5 mg/ml II型胶原酶于37 °C消化40分钟，再用TrypLE Express消化5分钟，经70 µm滤网过滤后包埋于Matrigel中。类器官培养使用添加了B27、N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin-1、Noggin、FGF-7、FGF-10、EGF、A83-01与SB202190的Advanced DMEM/F12完全培养基。类器官每1–4周按1:2–1:4比例传代，并可冻存复苏。
2. 组织学与免疫荧光分析。 类器官与肿瘤组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、4 μm连续切片后，进行苏木精-伊红（H&E）染色。免疫荧光分析使用针对CK19（cytokeratin 19）、Galectin-3、Ki-67及BRAF V600E突变蛋白的抗体，经EDTA抗原修复、BSA封闭后4 °C孵育过夜，再以CY3或Alexa Fluor 488标记的二抗结合，DAPI复染核，于蔡司显微镜下成像。
3. 全外显子组测序（WES）与数据分析。 对7对类器官与亲代肿瘤（PTC-3与PTC-9因肿瘤组织量不足未测序）以及配对癌旁正常组织提取基因组DNA。使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit建库，Illumina NovaSeq平台以150 bp双端模式测序，正常组织平均测序深度约100×，肿瘤及类器官约200×。下机数据经fastp过滤，BWA比对至GRCh37参考基因组，GATK Mutect2与Strelka2分别检测单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失（indels），Annovar进行功能注释，Control-FREEC分析拷贝数变异（CNVs），deconstructSigs解析突变特征。
4. 药物敏感性检测。 将类器官消化为单细胞或小细胞团，以10,000类器官/ml密度重悬于含2% Matrigel的培养基中，接种于超低吸附U底96孔板。次日加入药物，设置6个浓度点，以5倍梯度从3.2×10^-3至10 μM。药物包括BRAF^V600E抑制剂（vemurafenib、dabrafenib）、MEK抑制剂（selumetinib、trametinib）、酪氨酸激酶抑制剂（sorafenib、lenvatinib、cabozantinib、vandetanib、sunitinib）以及化疗药物（doxorubicin、vincristine、paclitaxel、cisplatin）。培养5天后，使用CellTiter-Glo 3D试剂检测细胞活力，以DMSO处理组为对照计算IC50与AUC。联合用药实验采用Chou-Talalay法计算联合指数（combination index, CI），CI<1表示协同，CI>1表示拮抗。所有实验均使用不同代次类器官进行3次生物学重复。
四、主要研究结果
1. PTC类器官成功建立并长期扩增。 9例患者的肿瘤组织均在1–2周内形成球形或囊性类器官，连续传代超过3个月无生长减缓或形态改变。类器官形成效率在BRAF^V600E突变组与野生型组间无显著差异（图1d），提示BRAF突变本身并不赋予体外自我更新优势。
2. 类器官高度保留亲代肿瘤的组织病理特征。 H&E染色显示，不同患者的类器官呈现致密实心或多孔囊性等异质性结构，与对应肿瘤组织形态一致（图2）。免疫荧光证实所有类器官均表达PTC标志物CK19与Galectin-3；PTC-1至PTC-5类器官及肿瘤组织均呈BRAF V600E突变蛋白阳性，而PTC-6至PTC-9均为阴性，与临床病理报告完全吻合。Ki-67在所有肿瘤与类器官中均有表达，部分类器官（如PTC-3_O、PTC-9_O）的增殖指数较亲代肿瘤升高，可能与肿瘤组织中混有间质及免疫细胞稀释了Ki-67阳性率有关。
3. 类器官维持亲代肿瘤的突变谱与拷贝数变异。 WES分析显示，类器官与配对肿瘤在癌症驱动基因的错义、无义、剪接位点及移码突变上高度一致（图4a）。碱基替换以C>T/G>A转换为主，突变特征贡献在各配对样本间保持稳定（图4b, c）。CNVs分析亦显示类器官与肿瘤组织具有相似的拷贝数获得与缺失模式（图4d）。由于取材部位的不同，部分样本间存在突变特征1等差异，研究者认为这反映了肿瘤内突变异质性。
4. 药物反应呈现患者特异性与突变依赖模式。 13种药物的剂量-反应曲线显示，不同患者类器官对同一药物的敏感性差异显著，同一患者对不同药物的反应亦不同。BRAF^V600E突变类器官对vemurafenib和dabrafenib表现出中等敏感，而野生型类器官完全耐药（图5c，图6a）。对MEK抑制剂selumetinib与trametinib的反应同样仅限于突变型类器官。vemurafenib与dabrafenib的活性谱呈正相关（Pearson rp=0.83），selumetinib与trametinib亦高度相关（rp=0.87），提示同类靶向药物在类器官模型中具有协同一致的反应模式。在TKI中，vandetanib抑制效果最强，sunitinib次之；sorafenib、lenvatinib与cabozantinib仅表现弱抑制。化疗药中，doxorubicin对所有9株类器官均有抑制效果，vincristine抑制6株，而所有类器官对cisplatin相对耐药。
5. BRAF抑制剂联合治疗增强BRAF^V600E突变类器官的敏感性。 在PTC-1类器官中，vemurafenib与MEK抑制剂（selumetinib、trametinib）、RTK抑制剂（lenvatinib、vandetanib）或化疗药物（doxorubicin、vincristine）联合使用均较单药显示出更强的生长抑制，CI分析表明联合用药具有协同效应（CI）。这一协同效应在其余4株BRAF^V600E突变类器官中得到验证。vemurafenib与trametinib联用对突变型类器官的杀伤效果显著优于单药，而野生型类器官对单药及联合治疗均不敏感（图7c）。该结果提示BRAF与MEK抑制剂联合方案可能在BRAF^V600E突变PTC中具有良好的临床转化前景。
五、结论与研究价值
本研究成功建立了9例患者来源的PTC类器官模型，涵盖BRAF^V600E突变型与野生型，类器官在组织病理、标志物表达及突变谱上高度模拟亲代肿瘤。药物敏感性检测证实类器官可反映患者间及患者内的异质性药物反应。更重要的是，BRAF抑制剂联合MEK抑制剂、RTK抑制剂或化疗药物可显著增强对BRAF^V600E突变类器官的杀伤作用，提示联合治疗较单药更具临床潜力。
本研究的科学价值在于：首次在PTC类器官平台上系统比较了BRAF抑制剂单药与联合方案的疗效，为BRAF^V600E突变PTC的联合治疗提供了直接的临床前证据。其应用价值在于：PTC类器官可作为“替身”模型用于预测个体患者对靶向药物的反应，辅助筛选最可能从BRAF靶向治疗中获益的患者，并可进一步用于发现新的协同药物组合。
六、研究亮点
第一，本研究使用的PTC类器官培养方法在既往工作基础上实现了长期稳定传代，并保留了亲代肿瘤的BRAF突变状态和突变谱。第二，研究涵盖了9例患者的类器官模型，样本量在甲状腺类器官领域较为可观，且同时包含突变型与野生型，有利于对比分析。第三，研究创新性地将BRAF抑制剂与多种类别的药物（MEK抑制剂、RTK抑制剂、化疗药）进行联合测试，并利用Chou-Talalay模型定量评估协同效应，为联合方案的选择提供了系统性数据。第四，类器官模型在体外再现了BRAF抑制剂单药疗效有限但联合用药显著增效的临床现象，具有较强的转化医学意义。
七、其他有价值内容
研究还观察到vandetanib与sunitinib对部分PTC类器官的抑制效果优于lenvatinib与sorafenib，这为临床TKI选择提供了参考。值得注意的是，研究者尝试将PTC类器官移植至NSG小鼠以建立PDX模型，但未成瘤，提示甲状腺癌类器官的体内成瘤性存在局限，仍需进一步优化条件。此外，研究纳入了患者临床病理信息（肿瘤分期、淋巴结状态等），为后续建立基因型-表型-药物反应关联分析奠定了基础。