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主要作者及机构
本研究由Bingxu Liu（通讯作者，华盛顿大学）、Nathan F. Greenwood（华盛顿大学）、Julia E. Bonzanini（华盛顿大学）等来自多个机构的团队合作完成，包括华盛顿大学生物化学系、蛋白质设计研究所、斯坦福大学医学院、纪念斯隆-凯特琳癌症中心等。研究于2025年7月24日发表在《Science》期刊上（第386卷）。

学术背景
该研究属于免疫治疗与蛋白质设计交叉领域，聚焦于I类主要组织相容性复合体（MHC-I）与肽段（peptide-MHC-I, pMHC-I）复合物的特异性结合蛋白设计。MHC-I分子在细胞表面呈递细胞内抗原肽段，供T细胞受体（TCR）识别，从而触发免疫应答。然而，天然TCR对疾病相关pMHC-I的特异性识别存在局限性，例如TCR库多样性不足、筛选成本高昂等。因此，研究团队旨在通过计算设计方法，开发高特异性、高亲和力的pMHC-I结合蛋白，以用于嵌合抗原受体（CAR）等免疫治疗工具。

研究流程
1. 计算设计pMHC-I结合蛋白
- 目标选择：选取11种结构多样的pMHC-I复合物作为靶标，涵盖HLA-A*01:01、A*02:01等常见等位基因及病毒肽、肿瘤抗原等。
- 生成蛋白骨架：使用生成式AI工具RFdiffusion，针对肽段表面残基设计蛋白骨架，使其覆盖MHC-I的肽段结合槽。通过多轮独立轨迹生成候选骨架，筛选出能与肽段广泛接触的构象。
- 序列优化：利用ProteinMPNN优化骨架序列，确保折叠与结合稳定性，并通过AlphaFold2（AF2）预测结合能力。
- 特异性验证：通过AF2模型评估设计蛋白与靶标肽段及相似肽段的结合差异，筛选出高特异性候选。

1. 实验验证结合能力

   • 酵母展示筛选：将设计的蛋白编码基因库（200-12,000种）展示于酵母表面，通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选特异性结合靶标pMHC-I的候选蛋白。
     
   • 晶体结构解析：对设计蛋白Mart1-3与pMHC-I复合物进行X射线晶体学分析（分辨率2.2 Å），验证其结构与计算模型的一致性（Cα RMSD=0.4 Å）。
     

2. CAR功能测试

   • T细胞激活实验：将设计蛋白整合至CAR中，转导Jurkat细胞，检测其对靶标肽段脉冲的293T细胞的CD69表达水平（激活标志）。例如，设计蛋白Mage-513仅激活Mage-A3肽段刺激的细胞，而对相似肽段（如心脏肌联蛋白来源肽段）无响应。
     
   • 细胞杀伤实验：用原代T细胞表达CAR，验证其对靶标肽段呈递细胞的杀伤能力。例如，针对WT1和PRAME的设计CAR能特异性杀伤相应肽段脉冲的靶细胞。
     

主要结果
1. 设计蛋白的高特异性
- 8种pMHC-I靶标的设计蛋白在酵母展示和CAR实验中均表现出对靶标肽段的特异性识别，且与AF3预测结构高度吻合。例如，SARS-CoV1肽段设计蛋白SARS-6通过疏水口袋结合肽段W4/L5，而HIV肽段设计蛋白HIV-10通过氢键网络识别K1/T8。
- 晶体结构证实Mart1-3与肽段的相互作用与设计模型一致，包括疏水作用（L5）和氢键（G6/I7/T9）。

1. 支架复用性

   • 通过“部分扩散”（partial diffusion）方法，将成功支架（如Mage-513）改造为针对其他pMHC-I（如GP100、PRAME）的结合蛋白，证明其通用性。
     

2. 临床前潜力

   • 针对预测结构（如PRAME/A*02:01）的设计蛋白仍能实现特异性激活，表明该方法对缺乏实验结构的靶标具有适用性。
     

结论与意义
该研究首次系统性实现了pMHC-I结合蛋白的计算设计，其核心价值在于：
1. 科学价值：揭示了通过计算设计实现肽段特异性识别的关键界面特征（如疏水相互作用、氢键网络），为免疫识别机制提供了新见解。
2. 应用价值：设计的蛋白可直接用于CAR-T疗法或双特异性抗体开发，克服传统TCR筛选的局限性，加速个性化免疫治疗。

研究亮点
1. 方法创新：结合RFdiffusion、ProteinMPNN和AlphaFold的多工具流程，实现了从设计到验证的高效闭环。
2. 临床转化潜力：针对肿瘤新抗原和病毒肽的设计蛋白已展示出体内外功能性，为广谱患者覆盖奠定基础。
3. 跨学科整合：融合结构生物学、人工智能和免疫学，推动了蛋白质设计在治疗领域的边界。

其他价值
研究团队公开了设计代码（Zenodo平台），并申请了专利（US ⁶³⁄₇₇₉,176），为后续研究提供资源。此外，针对交叉反应性的系统性评估（如酵母库扫描）为安全性优化提供了参考。