本研究由华中科技大学材料科学与工程学院的常伟、黄志伟、黄伟等人，联合浙江大学机械工程学院、华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的研究人员共同完成。通讯作者为吴斌（Bin Wu）。该研究于2025年2月28日在线发表于 International Journal of Bioprinting 期刊，文章标题为“Microstructure control during cryogenic 3D printing to obtain biomimetic porous and tough cross-scale mineralized collagen bone scaffold”。

研究背景与目的

大段骨缺损的修复在临床上仍面临巨大挑战。传统的自体骨或异体骨移植存在供体来源有限、二次创伤等问题，而金属植入物则存在降解性差和细胞存活率低等缺点。组织工程支架因能够诱导内源性骨再生而成为备受关注的替代方案。理想的骨组织工程支架需要具备高孔隙率（大于90%）、适宜的刚度（杨氏模量约1 MPa），并且其组成应尽可能模拟天然骨，包括矿化胶原成分以及跨宏观和微观尺度的结构。然而，现有的三维打印矿化胶原骨支架难以再现天然骨的跨尺度结构，通常孔隙率低于60%，刚度也仅有约100 kPa，远未达到理想要求。针对这一难题，本研究采用低温三维打印（cryogenic 3D printing），即低温场辅助直写技术，制备具有跨宏观-微观尺度结构的矿化胶原支架，并通过调控打印过程中的微观结构和原位矿化后处理来提升力学性能，同时保持高孔隙率。

研究流程与方法

研究首先制备了脱细胞小肠黏膜下层（decellularized small intestinal submucosa，DSIS）胶原浆料。将0.3 g DSIS粉末与0.03 g胃蛋白酶混合于10 mL的0.01 M盐酸中，在35°C下搅拌24小时，离心去除杂质后获得胶原浆料。随后利用自主搭建的低温三维打印设备进行支架打印。打印喷头内径为0.3 mm，纤维间距为0.6 mm，层高为0.25 mm，打印平台温度由自动冷却泵控制在-80°C至99°C范围内。打印过程中，浆料中的水在低温场作用下冻结成冰晶，形成冰模板；冻干后冰晶升华，在纤维内部留下微孔结构。通过调整打印速度（3 mm/s和20 mm/s）来改变低温梯度方向，从而控制冰晶生长方向并调控微层板（micro-lamella）的取向。为了探究温度场对微结构的影响，作者建立了有限元模型模拟低温打印过程中的热行为。模拟采用COMSOL Multiphysics软件，将打印轨迹简化为近似圆形截面，材料属性按纯水处理，边界条件设定为已打印层温度253 K，并沿打印方向施加速度场。网格划分采用四边形单元沿打印方向扫掠，边界单元数为7892，总单元数为100215。

打印完成后，对支架进行原位矿化后处理。支架先在含1 wt.% 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）的95%乙醇中交联4小时，再用3 wt.%碳酸氢钠中和残余盐酸，洗涤并冻干24小时。之后将支架依次浸泡在矿化液A（100 mM碳酸钠和30 mM氯化钠）中5小时，再转移至矿化液B（100 mM氯化钙、100 mM HEPES缓冲液和160 mg/mL聚丙烯酸）中10小时。聚丙烯酸用于维持钙离子处于前驱体状态，使矿物能够进入胶原纤维内部，实现纤维内矿化。

研究中对支架进行了多种表征。使用扫描电子显微镜（SEM）和能谱分析（EDS）观察微观结构和元素分布；利用X射线显微镜（XRM）观察内部微结构；通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和热重分析（TGA）确认矿化产物的化学组成；使用万能试验机进行压缩和拉伸测试以计算杨氏模量；通过落球冲击实验评价动态力学性能；在5 M盐酸中于37°C下进行加速酸降解实验；通过水接触角测量评价亲水性；并以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行细胞活性和生物相容性检测。孔隙率通过干湿称重法计算，每组测试5个样品。数据采用单因素方差分析进行统计。

主要研究结果

红外热像显示，在3 mm/s的低速打印时，同一层中仅有一条纤维温度高于0°C，说明已打印纤维能够充分冷却并作为冷源；此时低温梯度同时表现为垂直方向（来自下层冻结纤维）和水平方向（来自同层已冻结纤维）。而在20 mm/s高速打印时，整个层的纤维均保持在0°C以上，冷却时间不足，低温梯度仅表现为垂直方向。有限元模拟进一步显示，在20 mm/s时，温度流线在0.2秒内即趋于稳定并呈垂直取向；而在3 mm/s时，等温面间距更近，温度流线呈水平取向。这说明通过调节打印速度可以控制低温梯度的方向，从而调控冰晶生长方向和微层板取向。

SEM观察显示，低温打印支架内部形成了辐射状排列的层板状微孔结构。在悬空区域（不与相邻层纤维接触的区域），3 mm/s打印速度下左侧出现明显的水平层板（H），右侧因新冷源的出现转为垂直层板（V）；随着速度提高至20 mm/s，H区域减小而V区域增大。CT成像结果与模拟预测一致。原位矿化并未破坏支架的微结构，钙矿物颗粒嵌入微层板壁中，EDS证实了钙元素在支架表面和层板壁上的分布。

FTIR结果显示矿化支架在1200–1800 cm⁻¹范围内出现了较强的碳酸盐C–O和C=O键吸收峰，证实了碳酸钙的生成。热重分析表明不同打印速度组间矿化效果无显著差异。力学测试显示，20 mm/s组支架的拉伸模量为3.358 MPa，而3 mm/s组为0.684 MPa，提高了392.6%；压缩杨氏模量从0.404 MPa提高至0.595 MPa，提高了147.5%。经过原位矿化后，20 mm/s组支架的杨氏模量达到1.36 MPa，较3 mm/s未矿化组提高了240%。同时，支架孔隙率保持在95%，达到了理想骨组织工程支架的孔隙率和刚度要求。

落球冲击实验中，未矿化支架在0.5 m落高冲击后仍保持完整，球体反弹；而矿化支架则碎裂为多块，球未反弹。表面观察显示未矿化支架上形成了直径约1245.7 μm的凹坑，表明其具有一定的抗冲击能力。矿化改变了支架的能量吸收机制，由弹塑性变形转变为裂纹扩展为主的刚性破坏模式。加速酸降解实验显示，前2小时内三组支架降解速率约为11%/h；2至6小时矿化支架降解最快，达到约6.5%/h；6至10小时各组降解速率均降至约1%/h。10小时后，未矿化支架出现收缩形变，而矿化支架未发生形变，说明矿化无机盐对胶原具有一定的保护作用。水接触角实验显示，矿化支架的接触角由46.9°降低至35.91°，表明矿化提高了支架的亲水性。HUVECs在两种支架上均能正常贴附生长，无明显死细胞，证明支架具有良好的生物相容性。

结论与意义

本研究受天然骨跨尺度结构启发，利用低温三维打印技术制备了具有高孔隙率的跨尺度矿化胶原骨组织工程支架。通过调节打印速度控制低温梯度，实现了对支架微层板取向的调控；结合原位矿化后处理，使支架杨氏模量提高了240%。最终获得的支架孔隙率为95%，杨氏模量为1.36 MPa，与天然松质骨的性能接近，是一种有前景的骨修复候选材料。该研究为低温三维打印技术的创新和应用提供了新的指导，所制备的高孔隙率支架还可用于抗冲击、吸波、隔热、柔性材料和压电陶瓷等多个领域。未来研究应进一步深入探索冰晶生长机制，并克服低温三维打印在制备更复杂结构方面的挑战。