这项研究由中山大学肿瘤防治中心的张少平、邓爽、刘佳、刘爽等人，以及通讯作者黄旭东、张嘉良和林东昕教授团队完成，发表于 Gut 杂志（2025年1月16日在线发表）。研究旨在揭示胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）对曲美替尼（trametinib）耐药的分子机制，并寻找可干预的耐药相关靶点，以提高曲美替尼在耐药PDAC中的治疗效果。
PDAC是一种高度恶性的肿瘤，缺乏有效的治疗药物。约90%的胰腺癌患者携带KRAS致癌突变，但直接靶向KRAS突变非常困难。因此，研究者转向靶向KRAS下游的效应通路——丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。MAPK激酶1和2（MEK1/2）是该通路的核心激酶，在PDAC中异常激活，因此抑制MEK1/2被认为是一种有前景的治疗策略。曲美替尼是首个获美国食品药品监督管理局批准的MEK抑制剂，已在携带BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤中显示出疗效。然而，曲美替尼在PDAC的临床试验中失败，主要原因是肿瘤细胞产生了获得性耐药。虽然已有研究发现细胞周期、自噬、氧化磷酸化以及PI3K、mTOR、FAK、CDK4/6等代偿性通路激活与耐药有关，但针对这些通路联合曲美替尼的临床试验结果仍不理想，提示还存在其他更重要的耐药机制未被发现。因此，本研究旨在探索曲美替尼耐药的分子机制并寻找新的干预靶点。
研究团队首先建立了PDAC患者来源异种移植瘤（patient-derived xenograft, PDX）模型：将手术切除的PDAC组织移植到NOG免疫缺陷小鼠体内，然后用曲美替尼持续治疗。最初肿瘤生长被显著抑制，但治疗约1个月后，肿瘤重新快速生长，最终达到与对照组相近的体积，提示产生了获得性耐药。利用这些配对样本，研究者进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），在亲代肿瘤和耐药肿瘤中识别出8个不同的肿瘤细胞亚群，其中3个亚群（cluster 2、4、8）在耐药肿瘤中的占比超过50%。通路分析显示，cluster 2上调基因富集于细胞周期和凋亡通路，cluster 4与线粒体活性相关，而cluster 8则富集于I型干扰素（interferon, IFN）、抗病毒反应、RIG-I信号通路和细胞对双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）的反应，且大部分上调基因为干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs）。进一步分析发现，cluster 8细胞的ISG特征评分最高，且与dsRNA感知评分正相关。
为了验证病毒模拟反应（viral mimicry response）是否直接导致耐药，研究者从PDX中纯化出原代PDAC细胞（PDX-derived cells, PDCs）以及人胰腺癌细胞系MIAPaCa-2，通过在逐渐升高浓度的曲美替尼中长期培养6个月，建立了稳定的曲美替尼耐药细胞系。耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）较亲代细胞升高了数十倍。在耐药细胞中，磷酸化ERK1/2水平未出现再激活，说明耐药并非由MAPK通路重新激活引起。同时，耐药细胞中内源性逆转座子（transposable elements, TEs）转录水平显著升高，并产生了过量的dsRNA。dsRNA被模式识别受体RIG-I和MDA5识别后，激活MAVS和STAT1，进而上调ISG表达。此外，耐药细胞培养上清中的IFNβ水平显著升高，IFNα等未见明显改变。通过基因敲除RIG-I、MDA5或STAT1，或阻断IFNAR，均可恢复耐药细胞对曲美替尼的敏感性。STAT1的CUT&Tag测序进一步揭示，STAT1在耐药细胞中结合到多个抗凋亡基因的启动子区（如BCL2和CFLAR），从而抑制细胞凋亡，介导耐药。
为了寻找驱动TE过表达的上游机制，研究者进行了染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq），发现耐药细胞中大量TE位点的染色质可及性增加。结合转录因子筛选和相关性分析，发现只有转录因子MXD1的RNA水平与cluster 8细胞的dsRNA感知评分显著正相关。在曲美替尼治疗过程中，MXD1的RNA和蛋白水平随耐药建立时间逐渐升高。敲除MXD1可显著降低TE转录、dsRNA生成、ISG表达，并恢复耐药细胞对曲美替尼的敏感性；反之，在亲代细胞中过表达MXD1则显著增强耐药性。
进一步探讨MXD1调控TE转录的分子机制，研究人员发现MXD1本身可能无法直接改变染色质可及性，而是通过招募辅因子发挥作用。MXD1免疫沉淀-质谱分析鉴定出组蛋白甲基转移酶MLL1及其保守亚基RBBP5、ASH2L和WDR5。随后利用CUT&Tag测序技术，研究者发现MXD1、MLL1和H3K4me3在耐药细胞中的TE位点显著共富集。具体而言，MXD1作为先导调控因子，结合到TE位点后招募MLL1，后者催化组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3），促进局部染色质开放，进而增强TE转录。在MXD1敲除的耐药细胞中重新过表达MLL1可部分恢复TE表达和耐药表型，而敲除MLL1则显著抑制MXD1过表达诱导的TE转录和耐药性，证明MXD1通过MLL1发挥作用。
在探讨MXD1为何在耐药细胞中高表达时，研究者发现其启动子染色质可及性和前体mRNA水平在亲代和耐药细胞间无显著差异，提示存在转录后调控。RNA稳定性实验显示，耐药细胞中MXD1 mRNA的半衰期显著延长。通过分析RNA结合蛋白表达及相关性，并采用RNA免疫沉淀实验，研究人员证实RNA结合蛋白IGF2BP2（而非ZFP36）特异性结合MXD1 mRNA并增强其稳定性。敲低IGF2BP2可显著缩短MXD1 mRNA半衰期，并降低MXD1蛋白水平。
最后，研究者在动物模型中验证了靶向MXD1的治疗价值。在携带曲美替尼耐药PDAC细胞来源移植瘤的小鼠中，单独使用曲美替尼对肿瘤生长几乎没有抑制作用，而曲美替尼联合MXD1小干扰RNA（siMXD1）治疗几乎完全抑制了肿瘤生长，且未见明显肝、肾及造血系统毒性。在多个PDX模型中也观察到类似结果：先用曲美替尼治疗直至产生耐药后再联合siMXD1，可显著抑制肿瘤生长。免疫组化分析显示，联合治疗组肿瘤中Ki67表达显著下调，细胞凋亡增加，dsRNA水平降低。此外，在免疫系统人源化的小鼠模型中重复上述实验，同样证实了MXD1/TE/dsRNA/ISG通路在免疫健全条件下也参与了曲美替尼耐药。
本研究首次发现了PDAC中一群以病毒模拟反应过度激活为特征的耐药细胞亚群。曲美替尼长期治疗可诱导MXD1过表达，MXD1招募MLL1至TE位点，增加H3K4me3修饰，促进TE转录及dsRNA产生，激活RIG-I/MDA5/MAVS/STAT1通路，上调ISG及抗凋亡基因，最终导致PDAC细胞对曲美替尼的获得性耐药。更重要的是，抑制MXD1可有效恢复耐药肿瘤对曲美替尼的敏感性，为临床治疗提供了新的潜在靶点。
该研究的亮点包括：首次阐明TE转录和病毒模拟反应在曲美替尼耐药中的直接作用；首次揭示MXD1作为TE转录调控因子的新功能；发现了一种新的表观遗传调控轴MXD1-MLL1-H3K4me3；并证明IGF2BP2介导的MXD1 mRNA稳定性增加是其表达上调的机制。此外，该研究为KRAS抑制剂耐药机制的研究也提供了新的见解，因为KRAS下游驱动的转录组和磷酸化蛋白质组主要依赖于ERK MAPK活性，因此该耐药机制可能也适用于KRAS抑制剂耐药的场景。该研究还为表观遗传学改变在MEK抑制剂耐药中的重要性提供了新的证据。