自动化筛选抗蛋白适体的研究进展

作者及机构
本研究的通讯作者为美国德克萨斯大学奥斯汀分校化学与生物化学系的Andrew D. Ellington，第一作者J. Colin Cox来自该校细胞与分子生物学研究所。研究发表于2001年的《Bioorganic & Medicinal Chemistry》期刊（卷9，页2525–2531）。

学术背景
适体（aptamer）是通过体外筛选获得的核酸结合分子，能特异性识别蛋白质、小分子等靶标。传统适体筛选流程重复性强、耗时长，难以适应高通量需求。随着蛋白质组学（proteomics）的发展，亟需高效生成针对大量蛋白质的亲和试剂。尽管抗体是常用选择，但其依赖细菌转化的特性限制了通量。相比之下，适体筛选可通过体外化学完成，且已有研究证明其可自动化（如针对寡核苷酸靶标的筛选）。本研究旨在开发一种全自动筛选抗蛋白适体的方法，并以溶菌酶（lysozyme）为模型靶标验证其可行性。

研究流程与方法
1. 靶标与文库准备
- 靶标处理：选用鸡蛋清溶菌酶，经生物素化（biotinylation）后固定于链霉亲和素（streptavidin）包被的磁珠上。
- 核酸文库：使用含30个随机核苷酸的RNA文库（N30），初始库容量约1.1×10^14序列。

1. 自动化筛选平台

   • 设备配置：基于Beckman Coulter Biomek 2000工作站，整合了PCR仪、磁珠分离器、真空过滤装置和定制酶冷却系统。
     
   • 关键改进：
     
     • 过滤分离：取代传统磁珠捕获，采用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜真空过滤，减少非特异性结合。
       
     • 直接扩增：结合RT-PCR时，直接在高温（98°C）下从磁珠洗脱RNA，避免高亲和力适体重结合。
       
     • 循环优化：筛选初期用20轮PCR扩增，后期降至16轮，防止过度扩增。
       

2. 筛选步骤

   • 结合与洗涤：RNA库与靶标孵育6分钟，经两次1 mL缓冲液洗涤去除未结合序列。
     
   • RT-PCR扩增：洗脱的RNA直接用于逆转录PCR，通过放射性标记（α-32P-dATP）追踪产物。
     
   • 体外转录：10% PCR产物作为模板生成下一轮RNA库，20%用于下一轮筛选。共进行12轮筛选，耗时约42小时。
     

3. 适体表征

   • 克隆测序：筛选后群体经TA克隆（TA cloning）测序，获得6种优势适体序列。
     
   • 结合活性检测：通过硝化纤维素膜结合实验测定结合率，克隆1（占比61%）的解离常数（Kd）为31 nM（未生物素化靶标）。
     
   • 功能验证：克隆1以10倍摩尔比抑制溶菌酶对细菌细胞壁的裂解活性，证实其功能性抑制能力。
     

主要结果
1. 筛选效率：12轮筛选后，群体结合率从初始0.8%提升至68.1%，克隆1富集倍数达10^12。
2. 适体特性：
- 所有克隆均显示靶标依赖性结合，仅克隆2存在轻微膜结合背景。
- 生物素化未显著影响适体亲和力（Kd差异倍）。
3. 功能抑制：克隆1完全阻断溶菌酶活性，而未筛选RNA无此效果，印证适体倾向于结合功能位点的“归巢原理”（homing principle）。

结论与意义
1. 技术价值：本研究首次实现抗蛋白适体的全自动化筛选，通量较人工提升10–100倍（单台设备月产120种适体）。
2. 应用前景：
- 蛋白质组学：适配高通量需求，助力蛋白质相互作用图谱构建。
- 药物开发：功能性适体可直接抑制靶蛋白，如克隆1对溶菌酶的抑制案例。
3. 方法创新：
- 磁珠-过滤联用策略降低假阳性。
- 自动化流程整合多模块，减少人为误差。

研究亮点
1. 高通量突破：单次运行可并行8组筛选，未来升级至96通道后月通量可达1000+靶标。
2. 跨领域适用性：靶标从寡核苷酸扩展至蛋白质，为代谢组（metabolome）适体开发铺路。
3. 质量控制：通过减少PCR循环数、优化缓冲液（如剔除精胺）保障筛选严谨性。

局限性：部分靶标（如非碱性蛋白）可能因结合特性差异需进一步优化流程。

致谢：研究获美国陆军研究办公室（DAAD19-99-1-0207）和Beckman Coulter技术奖助（26750695）支持。

（注：适体（aptamer）、蛋白质组学（proteomics）、解离常数（Kd）等术语首次出现时标注英文原词。）