本研究由上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心皮肤科的刘文尚（wen-shang liu）、海军军医大学第一附属医院胃肠外科的卢正茂（zheng-mao lu）以及河南大学药学院的蒲晓辉（xiao-hui pu）等人共同完成，通讯作者为张晓伟（xiao-wei zhang，复旦大学上海肿瘤中心）、高洁（jie gao，海军军医大学第一附属医院）和李萌（meng li，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心）。该研究于2024年8月30日在线发表于 Biomaterials 期刊（第313卷，文章编号122776），是一项关于黑色素瘤术后复发预防与感染伤口愈合促进的原创性研究。
黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤，虽然发病率相对较低，但其致死率极高。传统治疗手段如放疗和化疗对黑色素瘤效果有限，手术切除仍是治疗的基石。然而，手术无法完全清除所有肿瘤细胞，导致术后复发率居高不下，同时术后炎症微环境和组织缺损增加了继发感染的风险，阻碍健康组织再生。因此，临床上迫切需要一种既能清除残余肿瘤细胞、又能促进手术部位伤口愈合的辅助治疗平台。
肿瘤疫苗旨在诱导针对多种肿瘤抗原的精确免疫应答，但其临床效果受限于免疫原性弱、抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs）招募不足和高效递送系统缺乏等问题。近年来研究发现，氧化或老化的红细胞具有趋化树突状细胞（dendritic cells，DCs）的能力，而血凝块对DCs具有趋化效应，可实现DCs的原位（in situ）招募。此外，肿瘤细胞来源的纳米囊泡（nanovesicles，NVs）富含肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs），可作为全抗原疫苗激发全面免疫应答。水凝胶因其优异的生物相容性和可调控性，在肿瘤免疫治疗领域备受关注。小球藻（chlorella）提取物具有抗菌活性且不易产生耐药性，同时可能促进内皮细胞和成纤维细胞迁移，加速伤口愈合。
基于上述背景，本研究旨在开发一种创新的可注射血凝块水凝胶系统，整合肿瘤疫苗和小球藻提取物，用于黑色素瘤术后预防肿瘤复发并促进感染伤口愈合。
本研究包含多个层次的实验流程，涵盖了从材料制备、体外实验到动物模型验证的完整链条。
3.1 水凝胶的制备与表征
研究团队首先通过连续挤出法制备了B16F10黑色素瘤细胞来源的NVs作为肿瘤疫苗：将培养至约80%融合度的细胞经酶消化后，依次通过孔径递减（5 μm、1 μm、0.2 μm）的聚碳酸酯膜过滤器，随后在1500×g离心30分钟，取上清再于14000×g离心1小时收集NVs。所得NVs粒径为186.7 ± 1.185 nm，多分散指数为0.247 ± 0.015，形态近球形且均一。SDS-PAGE分析证实NVs表面保留了来源细胞的TAAs和内在危险信号。小球藻提取物采用聚乙二醇200（PEG200）在80°C水浴中提取4小时，经10,000 rpm离心10分钟并过滤获得。血液取自健康成年C57BL/6小鼠眼眶静脉丛，经抗凝处理后于4°C保存。
水凝胶的制备以海藻酸钠（sodium alginate，SA）为基础，将其溶解于含磷酸钙粉末的超纯水中，加入PEG4000搅拌至均匀，冷却后按比例加入肿瘤疫苗、小球藻提取物和血液，混合均匀后加入葡萄糖酸内酯（gluconolactone）触发相变，形成可注射的血凝块水凝胶（命名为hvcb）。同时制备了对照水凝胶：单纯海藻酸水凝胶（h）、海藻酸-肿瘤疫苗水凝胶（hv）和海藻酸-肿瘤疫苗-小球藻提取物水凝胶（hvc）。
水凝胶的表征包括：流变学分析（锥板流变仪测定储能模量G′和损耗模量G″）、溶胀率测定（PBS中浸泡9小时）、体外降解实验（37°C PBS中27天，每3天称重）、药物释放动力学（以负载罗丹明B的阴离子脂质体模拟NVs）、溶血实验（兔红细胞悬液孵育1小时，测定545 nm吸光度）以及细胞毒性实验（DC2.4和NIH/3T3细胞经CCK-8法检测）。
3.2 体外免疫激活研究
从骨髓中分离培养骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs），与水凝胶提取物共培养24小时，通过流式细胞术检测CD80、CD86和CD40的表达以评估DCs成熟度，并通过ELISA检测上清中白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平。抗原呈递能力研究使用过表达卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的NVs，检测BMDCs表面H-2Kb-SIINFEKL复合物的表达；同时将水凝胶刺激后的DCs与CFSE标记的原代T细胞共培养72小时，通过流式细胞术分析CD8+ T细胞的增殖。
3.3 体外抗菌性能研究
以大肠杆菌（*E. coli*）和金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）为模型菌，将水凝胶与细菌悬液共培养，通过测定600 nm处光密度（OD）监测细菌生长，平板菌落计数法评估抑菌率，并用扫描电子显微镜（SEM）观察细菌形态变化。
3.4 动物实验
使用体重20-22 g、5-6周龄的成年雄性C57BL/6小鼠，经上海长海医院动物研究伦理委员会批准（批准号2024-002）。DCs体内招募实验：将不同水凝胶皮下注射至小鼠背部，3天后取出水凝胶，经红细胞裂解后通过流式细胞术分析CD45+CD11c+细胞的浸润比例以及CD80+、CD86+的表达。黑色素瘤术后复发预防模型：将5×10⁵个B16F10细胞接种于小鼠侧腹，待肿瘤体积达到50 mm³时手术切除约95%肿瘤并缝合，术后第二天注射不同水凝胶（对照组、h、hv、hvc、hvcb组），每两天监测肿瘤体积和小鼠体重，共观察24天。实验结束后收集肿瘤、淋巴结和主要脏器进行流式细胞术分析和免疫组化染色。感染伤口愈合模型：在小鼠背部造成直径8 mm的圆形全层皮肤缺损并接种*S. aureus*诱导感染，感染后48小时开始治疗，定期拍照并用ImageJ软件测量伤口面积，计算伤口闭合率。第12天收集皮肤组织进行H&E染色、Masson三色染色以及CD31和α-SMA免疫荧光染色。
4.1 水凝胶表征结果
NVs粒径约187 nm，分布均一，14天稳定性评估显示粒径仅从187.5 nm轻微增至206.8 nm，表明其稳定性良好。小球藻提取物的紫外光谱在267 nm附近有最大吸收峰，提示成功提取了芳香族氨基酸、蛋白质或核酸；约210 nm处的吸收峰提示存在肽类分子；410 nm和660 nm处的小吸收峰表明含有叶绿素和叶黄素。流变学结果显示水凝胶的损耗模量G″始终大于储能模量G′，具有典型的凝胶特性。四种水凝胶在9小时内的溶胀率较低，27天体外降解率达80%，体内实验显示约20天即可完全降解。药物释放曲线呈现初始突释后逐渐减缓的持续释放模式，可维持20天以上。溶血率均低于2%，对DC2.4和NIH/3T3细胞无显著毒性，证明水凝胶具有良好的血液相容性和生物相容性。
4.2 体外免疫激活结果
hv组BMDCs的CD80/CD86阳性率显著高于对照组和h组（p<0.0001），hvc组较hv组进一步提高（p<0.01）；CD40的表达趋势一致。ELISA结果显示hv组BMDCs分泌的IL-6和TNF-α分别是对照组的2.3倍和4.1倍以上，hvc组较hv组分别提高1.8倍和2.5倍。抗原呈递实验中，hv组的H-2Kb-SIINFEKL阳性率显著高于对照组和h组（p<0.01），hvc和hvcb组的阳性率极显著高于hv组（p<0.0001）。T细胞增殖实验中，CFSE阴性率在hvc组为39.7±4.8%，hv组为26.6±4.3%，h组仅为4.8±0.1%，表明NVs激活了BMDCs进而活化了CD8+ T细胞，而小球藻提取物作为免疫佐剂增强了这一过程。
4.3 体外抗菌结果
平板菌落计数显示对照、h和hv处理的琼脂板上细菌大量生长，而hvc和hvcb处理的板上几乎无菌落。细菌生长曲线表明hvc和hvcb组的细菌生长几乎被完全抑制。SEM观察显示hvc和hvcb处理导致*E. coli*和*S. aureus*严重变形和收缩，证实小球藻提取物的强大抗菌活性。
4.4 体内DCs招募结果
Transwell迁移实验显示hvcb组的细胞迁移速度显著高于其他组（p<0.001）。体内实验中，hvcb组水凝胶内CD45+CD11c+细胞浸润最为显著（p<0.001）。DCs成熟度分析显示hv组CD11c+CD80+比例显著高于h组（p<0.05），hvc组较hv组进一步升高（p<0.05），hvcb组成熟度最高。这一现象推测是由于血凝块中受损红细胞释放的血红蛋白、血红素铁等物质触发了天然免疫细胞的炎症性激活，与体外实验结果形成互补。
4.5 黑色素瘤术后复发预防效果
肿瘤体积分析显示：对照组和h组肿瘤体积分别增加了37.5倍和34倍；hv组增加23.2倍；hvc组增加7.6倍；hvcb组仅增加2.3倍。肿瘤重量方面，hvcb组显著低于hvc和hv组（p<0.001），hvc组显著低于hv组（p<0.01）。H&E染色显示hvcb组肿瘤组织出现明显的细胞质消融和核变形。各组小鼠体重无显著差异，主要脏器H&E染色未见异常，表明治疗无系统毒性。
4.6 抗肿瘤免疫机制分析
肿瘤引流淋巴结中DCs成熟度分析显示hv组显著高于对照组和h组（p<0.01），hvcb组成熟度最高（p<0.0001）。肿瘤组织中CD3+CD8+ T细胞浸润以hvcb组最为显著（p<0.0001）；CD8+IFN-γ+ T细胞比例同样在hvcb组最高。免疫组化显示hvcb组肿瘤组织中CD8表达显著增加，CD31表达显著降低（p<0.001），提示肿瘤血管生成受到抑制。TUNEL凋亡检测显示hvcb组肿瘤细胞凋亡程度最高（p<0.001）。
4.7 感染伤口愈合效果
第7天时hvc和hvcb组的伤口闭合率显著高于对照组（p<0.01）；第12天时hvc组达到99.3±1.2%、hvcb组达到99.6±0.4%，显著高于h组（89.2±2.8%）和hv组（90.6±2.6%）（p<0.0001）。伤口细菌负荷检测显示hvc和hvcb组的菌落形成单位几乎可忽略。H&E染色显示hvc和hvcb组有毛囊等皮肤附属器再生；Masson染色显示这两组胶原沉积显著增加（p<0.0001）。免疫荧光显示hvc和hvcb组CD31和α-SMA表达显著上调（p<0.001），表明新生血管形成增强。
本研究成功构建了一种多功能血凝块水凝胶（hvcb），该水凝胶利用血凝块对DCs的天然趋化性实现原位免疫细胞招募，以肿瘤来源的NVs作为全肿瘤疫苗，以小球藻提取物同时发挥免疫佐剂和抗菌剂的双重功能。三者协同作用，在黑色素瘤术后模型中显著抑制了肿瘤复发（肿瘤体积仅增加2.3倍），并在感染伤口模型中实现了99.6%的伤口闭合率。该策略的个性化特征——血液和肿瘤疫苗均可直接取自患者——为术后黑色素瘤的个体化治疗提供了新的可能。
本研究的主要亮点包括：（1）首次将血凝块的DCs趋化特性与肿瘤NVs疫苗相结合，通过原位招募策略克服了传统皮下疫苗注射的局限性；（2）发现小球藻提取物的双重功能——不仅具有抗菌促愈作用，还能增强抗肿瘤免疫应答；（3）该水凝胶系统采用患者来源的血液和NVs，真正实现了个体化定制；（4）通过系统的体内外实验阐明了从DCs招募、成熟、抗原呈递到T细胞活化、肿瘤浸润的完整免疫激活链条。
研究还发现水凝胶的大孔径网络结构（约100 μm）在不妨碍免疫细胞进入的同时，有效实现了纳米级载体的持续释放，这一结构-功能关系的揭示为设计用于免疫治疗的生物材料递送系统提供了重要参考。