关于金属络合对DOTA配体辐射稳定性的影响研究
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自法国原子能与替代能源委员会（CEA）、德西研究所（DES）、分离化学研究所（ISEC）、德马库勒中心（Marcoule）以及蒙彼利埃大学（Univ Montpellier）的研究人员共同完成。主要作者包括Ilyes Mahti、Dominique Guillaumont*、Claude Berthon、Georges Saint-Louis、Xavier Hérès和Laurence Berthon*（*为通讯作者）。该研究成果以论文形式发表于英国皇家化学会（RSC）旗下的期刊《Dalton Transactions》，具体卷期为2023年第52卷，页码从9952至9963。论文于2023年3月30日收到，同年6月24日被接受，并于6月30日在线发表。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于核医学与配位化学、辐射化学交叉的前沿领域。随着放射性金属（如锆-89，⁸⁹Zr）在正电子发射断层扫描（PET）成像和靶向放射性核素治疗中的广泛应用，寻找和优化能够稳定螯合这些金属离子的配体至关重要。DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）作为一种经典的多氨基多羧酸类螯合剂，因其与多种金属离子（包括⁸⁹Zr）形成高热力学稳定性和优异体内稳定性的络合物而被广泛使用。
然而，在实际应用中，螯合剂分子会直接暴露于放射性核素发射的辐射场中。辐射（特别是高能γ射线）作用于水溶液会产生大量活性自由基（如·OH、H·等），这些自由基可能攻击并降解螯合剂的结构，从而改变其络合性能，最终导致放射性金属离子在体内非特异性释放，带来潜在风险并影响诊疗效果。尽管已有研究关注其他多氨基羧酸（如EDTA、DTPA）的辐射稳定性，但关于DOTA，特别是其与⁸⁹Zr形成的络合物的辐射化学行为，此前缺乏系统研究。
因此，本研究的核心目的是：首次系统研究并比较水溶液中游离DOTA配体及其与锆（Zr）形成的Zr-DOTA络合物在伽马辐射下的稳定性差异。具体目标包括：1）识别并对比两者在辐照后的主要降解产物；2）基于产物分析，分别提出DOTA和Zr-DOTA的可能降解路径；3）探究金属络合作用对配体抗辐射降解能力的影响（即是否存在“保护效应”）；4）借助密度泛函理论（DFT）计算，从化学键强度和反应位点活性的角度，深入理解实验观察到的现象，为预测络合物的辐射稳定性提供理论描述符。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了实验辐照与表征结合理论计算验证的综合研究策略，流程清晰，环环相扣。
1. 样品制备与表征： * 研究物体： 研究对象为DOTA配体（H₄DOTA）及其与锆（IV）形成的Zr-DOTA络合物。所有化学品均购自商业来源，纯度经高效液相色谱（HPLC）或供应商数据确认。 * Zr-DOTA合成： 在室温下，按金属：配体1:1的摩尔比，将DOTA溶于甲醇，随后缓慢加入四乙酰丙酮锆（Zr(acac)₄）。混合后离心分离上清液，数天后析出白色沉淀，经分离干燥得到Zr-DOTA粉末。合成产物通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱进行了表征确认（谱图见论文电子补充信息ESI）。 * 溶液配制： 将DOTA和Zr-DOTA分别溶解于超纯水中，配制成浓度为5×10⁻³ mol L⁻¹的待辐照溶液。值得注意的是，为排除酸碱性物种对辐射化学过程的干扰，研究未将配体与络合物溶液的pH值调节至一致（辐照前DOTA溶液pH≈3.51，Zr-DOTA溶液pH≈5.7）。作者指出，在pH 3-11范围内，伽马辐照下水的主要辐解产物产额变化不大。
2. 伽马辐照实验： * 辐照条件： 使用¹³⁷Cs伽马射线源（Gamma-Service-Medical-GmbH辐照系统）在CEA Marcoule进行辐照。剂量率约为0.8-0.9 kGy h⁻¹，通过Fricke剂量法进行标定。 * 剂量设计： 尽管实际⁸⁹Zr药物溶液的剂量率较低（约0.3 kGy h⁻¹），但为了在可接受的时间内产生可检测的降解产物以进行比较研究，实验采用了更高的剂量率。所有样品（DOTA和Zr-DOTA）在完全相同的条件下（浓度、剂量、剂量率）进行辐照，以确保可比性。样品分别辐照12、24、36、120小时，对应吸收剂量约为10、20、30、100 kGy。辐照后测量了各样品pH值的变化。
3. 辐照后分析： * 核磁共振氢谱（¹H NMR）分析： 使用400 MHz NMR谱仪对辐照前后的样品进行¹H NMR分析。采用外锁溶剂（CDCl₃或丙酮-d6）进行信号锁定和谱图归一化，以比较不同剂量下信号强度的变化。通过积分特定信号峰的面积，定量评估DOTA和Zr-DOTA随剂量增加而减少的程度，并计算了表观降解速率常数（D）和辐射分解消失产额（-G₀）。 * 电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析： 使用高分辨率四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）对辐照样品进行定性分析。样品用纯水或酸化水稀释后进样，在正离子模式下检测。通过与模拟同位素谱图对比，鉴定辐解产物的分子量，并利用MS/MS实验对主要产物进行结构验证（部分数据见ESI）。
4. 理论计算（DFT）： * 计算目的： 从电子结构层面解释实验现象，预测分子中易受自由基攻击的位点，并量化络合作用对化学键强度的影响。 * 计算方法与软件： 使用Gaussian 16软件包进行密度泛函理论（DFT）计算。几何结构优化和频率计算在B3LYP泛函水平下进行，溶剂（水）效应通过极化连续介质模型（IEFPCM）考虑。对于锆原子，使用了Stuttgart-Cologne quasi-relativistic有效核势（ECP）及其相关基组。 * 计算描述符： * 键解离能（Bond Dissociation Energy, BDE）： 用于评估分子中特定化学键的均裂强度。计算了DOTA（考虑其在水溶液pH 3-4下的主要质子化形态H₄DOTA）和Zr-DOTA中乙酸臂上的关键化学键（N–C, C–C, C–O, C–H）的BDE值。计算采用B3P86泛函，因其对类似键能的预测与实验值吻合较好。 * 福井函数（Fukui Function）与福井指数（Fukui Indices）： 用于预测分子中各个原子位点对亲核、亲电或自由基攻击的敏感性。本研究重点计算了针对自由基攻击的福井函数（ƒ⁰）和福井指数，以图形和数值形式展示分子的局部反应活性。 * 凝聚双描述符（Condensed Dual Descriptor, CDD）： 提供关于特定原子位点倾向于发生亲核或亲电攻击的进一步信息。
四、 主要研究结果
1. 辐照稳定性对比（NMR与MS结果）： * ¹H NMR结果： 辐照后，游离DOTA溶液的NMR信号强度显著下降（30 kGy时平均信号强度下降94%），且乙酸臂对应的信号发生位移，并在1-3 ppm及7.38 ppm处出现新的信号，表明降解产物生成。相比之下，Zr-DOTA络合物的NMR信号强度下降幅度小得多（30 kGy时下降42%），且原络合物信号未发生明显位移，新出现的信号也更少。这直观表明，Zr-DOTA络合物比游离DOTA配体具有更强的抗辐射降解能力。计算得到的表观降解常数D和-G₀值也证实了这一点：DOTA的-G₀值（0.625 ± 0.015 μmol J⁻¹）远高于Zr-DOTA（0.096 ± 0.015 μmol J⁻¹）。 * ESI-MS结果： 对游离DOTA溶液，辐照后检测到的主要降解产物质荷比（m/z）为347、317和361，分别对应DOTA失去一个乙酸臂（-CH₂COOH）、失去两个CO₂以及失去一个CO₂。这表明游离DOTA的降解途径以脱羧和乙酸臂断裂为主。对Zr-DOTA溶液，主要降解产物m/z为433和507。m/z 433同样对应失去一个乙酸臂，但其信号强度很弱。而m/z 507的产物（质量增加16）则是一个新出现的、在游离DOTA中未观察到的物种，对应于Zr-DOTA分子上增加了一个氧原子（可能是羟基化，形成Zr-DOTA[O]）。这表明Zr-DOTA的降解路径与游离DOTA不同，倾向于发生氧化反应。 * pH变化： DOTA溶液辐照后pH从3.51升至4.51，可能与CO₂释放有关；而Zr-DOTA溶液pH从5.7降至约3.4，可能与乙酸释放及锆的水解有关。
2. 降解路径推测： 基于质谱鉴定结果，研究者分别提出了简化的降解路径图。 * DOTA： 主要路径为自由基攻击导致乙酸臂的C–C键或N–C键断裂，失去CH₂COOH单元（脱羧或脱乙酸），生成分子量更小的产物。 * Zr-DOTA： 主要路径可能涉及C–H键均裂，生成氢气和一个脱氢自由基中间体，该中间体再与溶液中的·OH自由基结合，导致分子羟基化（增加一个O原子），形成氧化产物。乙酸臂的断裂虽然也存在，但程度很轻。
3. 理论计算验证与机理阐释： * 键解离能（BDE）分析： * 对于游离的H₄DOTA，计算显示乙酸臂上N–C键的BDE值最低（257 kJ mol⁻¹），是最弱的键。这完美解释了实验观察到的DOTA优先通过失去乙酸臂（CH₂COOH）而降解的现象。 * 对于Zr-DOTA络合物，所有计算的化学键（C–C, N–C, C–O）的BDE值（720-1068 kJ mol⁻¹）都远高于游离H₄DOTA中对应键的BDE值（300-500 kJ mol⁻¹）。这表明与Zr⁴+络合后，配体骨架的化学键得到了显著增强。 * 有趣的是，H₄DOTA中质子化的氮原子所连接的乙酸臂，其N–C键的BDE值（669 kJ mol⁻¹）也远高于未质子化氮的BDE值（257 kJ mol⁻¹），并且与Zr-DOTA中的BDE值处于同一数量级。这说明阳离子（H⁺或Zr⁴+）的存在本身就能稳定与之配位的氮原子及其相连的化学键。 * 在Zr-DOTA中，C–H键的BDE值相对最低，这支持了实验观察到的氧化降解路径（C–H键断裂引发羟基化）。 * 福井函数与指数分析： * 自由基福井函数图显示，无论是H₄DOTA还是Zr-DOTA，反应活性最高的区域（红色区域）都集中在羧酸根氧原子周围。对于H₄DOTA，未质子化的氮原子也显示出较高的反应活性，而质子化氮则活性较低。对于Zr-DOTA，氮原子上几乎没有显示高反应活性区域。 * 定量的福井指数（ƒ⁰）和凝聚双描述符（|CDD|）值得出了相同结论：对于两种分子，最易受自由基攻击的位点都在乙酸臂上（C(COOH)、N、C(CH₂)），而非环己胺环上的碳原子。更重要的是，Zr-DOTA上所有相关原子的ƒ⁰和|CDD|值都显著低于H₄DOTA，从理论上证实了Zr-DOTA整体上对自由基攻击的抵抗力更强。同时，计算也表明氮原子与阳离子（H⁺或Zr⁴+）结合后，其反应活性指数降低，即受到了“保护”。
五、 研究结论与价值
本研究首次系统评估并比较了水溶液中游离DOTA配体及其Zr(IV)络合物在伽马辐射下的稳定性，并深入揭示了金属络合对配体辐射稳定性的影响机制。
主要结论如下： 1. 降解路径不同： 游离DOTA主要通过脱羧和乙酸臂断裂降解；而Zr-DOTA则倾向于发生氧化反应（如羟基化），乙酸臂断裂程度很轻。 2. 金属的保护效应： 实验数据（NMR信号衰减程度、降解产物种类与数量、-G₀值）一致且明确地表明，与Zr⁴+络合后，DOTA配体的辐射降解程度显著降低。金属离子对配体起到了有效的“保护”作用。 3. 理论机制阐释： DFT计算为上述实验现象提供了坚实的理论支撑。络合作用大幅提高了DOTA分子中关键化学键（尤其是N–C键）的强度（BDE值升高），使其更难被自由基攻击而断裂。同时，福井函数分析表明，络合后分子整体的反应活性位点敏感性下降。这种保护效应可归因于阳离子（Zr⁴+或H⁺）与配体给体原子（如氮）的配位，稳定了局部电子结构。
科学价值与应用意义： * 科学价值： 本研究深化了对金属络合物在辐射场中化学行为的理解，明确了络合作用不仅能改变配体的降解路径，更能显著提升其抗辐射稳定性。它将实验辐射化学与理论计算化学紧密结合，展示了BDE和福井函数等描述符在预测和解释分子辐射稳定性方面的实用性。 * 应用价值： 对于核医学领域，特别是基于⁸⁹Zr等放射性金属的诊疗一体化药物开发具有重要指导意义。研究结果支持使用DOTA作为⁸⁹Zr的螯合剂，因为形成的Zr-DOTA络合物不仅热力学稳定，还具有优于游离配体的辐射稳定性，这有助于确保放射性药物在贮存和使用期间的完整性，减少因配体降解导致的金属离子释放风险，从而提高诊疗的安全性和有效性。此外，该研究提示，在设计新型放射性药物螯合剂时，应考虑金属络合对配体辐射稳定性的潜在增强作用。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
论文在讨论部分还提及了本研究的一些局限性和未来展望： * 本研究使用的是伽马射线源，而⁸⁹Zr衰变链中包含高能γ射线（来自⁸⁹mY），因此伽马辐照具有代表性。但⁸⁹Zr本身也是β⁺发射体，由于传能线密度（LET）不同，β射线可能产生略有差异的降解产物分布，未来可进一步研究。 * DOTA也是许多α发射体核素（如²²⁵Ac）的常用螯合剂。α粒子具有更高的LET和短射程，且治疗用核素半衰期较长，因此DOTA在α核素存在下的辐射稳定性可能不同，值得后续研究。 * 在实际应用中，DOTA常与靶向肽或抗体等载体分子连接。载体分子的存在可能影响DOTA的辐射稳定性和热力学稳定性，这也是未来需要关注的研究方向。
这项研究是一项设计严谨、数据详实、分析深入的工作，对核医学、放射化学和配位化学领域的研究人员和药物开发者具有重要的参考价值。