学术报告：病原生物学与蛋白质组学研究——基于定量蛋白质组学的小鼠脑和肺组织中肠道病毒71型（EV71）相关病理特征研究
作者与研究背景
这项研究的主要作者包括Yuefei Jin, Dong Li, Tiantian Sun等，隶属于郑州大学公共卫生学院流行病学部门，以及郑州大学河南分子医学重点实验室和杜克大学医学中心免疫学系等多个机构。研究于2021年6月18日发表在《Frontiers in Microbiology》期刊的病毒学板块，文章标题为“Pathological Features of Enterovirus 71-Associated Brain and Lung Damage in Mice Based on Quantitative Proteomic Analysis”。
手足口病（HFMD）是一种由人类肠道病毒（属于小RNA病毒科）引起的儿童常见传染病，其中，肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）是其重要的致病原之一。EV71由于能引发致死性脑炎及神经源性肺水肿，已成为全球公共卫生紧急事件。尽管近年来疫苗接种获得一定成效，但肠道病毒71型的发病机制、分子特性及其引发的脑炎与肺水肿的病理特征仍未完全阐明。因此，本研究旨在利用基于质谱的蛋白质组学技术，对EV71感染小鼠的脑和肺组织中因特定蛋白变化导致的病理特征进行深入分析，探讨EV71相关疾病的潜在分子机制。
研究流程与实验设计
研究设计分为以下几个具体步骤：
实验对象及其样本采集
- 实验动物为3日龄特定病原体无关的BALB/c幼鼠，对照组与实验组人数分别为4只。实验组通过腹腔注射2 × 10^6 PFU的EV71病毒（ZZ1350株）感染，而对照组注射相同体积的人横纹肌肉瘤（RD）细胞培养上清液。
- 感染后7天，分别取两组小鼠的大脑和肺组织，用于定量蛋白质组学、免疫组织化学分析（IHC）、和Western blot检测。
组织处理与蛋白质提取
- 组织均以裂解液裂解并提取蛋白；
- 用BCA法检测蛋白浓度；
- 对蛋白进行还原、碱基化处理并用胰酶消化。
TMT标记定量与分级纯化
- 使用TMT试剂进行标签定量：对照组分别标记为126、127n、127c和128n标签，实验组标记为128c、129n、129c和130n。
- 利用高pH反向高效液相色谱（HPLC）对肽段进行分级分离提纯。
质谱分析与蛋白质鉴定
- 使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）获取蛋白质数据；
- 将质谱数据导入MaxQuant搜索引擎，匹配小鼠数据库并鉴定蛋白；
- 设置定量和统计标准：差异蛋白表达变化显著标准为p < 0.05且表达量变化>1.2倍（上调）或/1.2倍（下调）。
生物信息分析与验证
- 利用Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库对鉴定的差异蛋白执行功能和通路富集分析；
- 构建蛋白-蛋白相互作用网络（PPI），并结合Western blot和组织免疫化学实验进行结果验证。
实验主要结果与数据分析
差异蛋白表达分析
- 在小鼠脑组织中检测到5,520种定量蛋白，其中148种发生显著变化（89种上调，59种下调）；在肺组织中检测到5,497种定量蛋白，其中78种发生显著变化（41种上调，37种下调）。
- 脑组织的差异蛋白主要涉及细胞核、胞质等结构，提示病毒感染可能诱导基因转录活动；肺组织多与细胞外基质蛋白表达失调相关。
GO与KEGG分析的生物学功能解读
- 脑组织：
- 差异蛋白显著富集于补体和凝血级联反应、氮代谢、抗原加工与呈递等通路；
- 激活的免疫通路包括JAK-STAT信号通路和NOD样受体信号通路，这些通路可能诱导抗病毒效应，并在炎症因子过量产生时导致继发性组织损伤。
- 肺组织：
- 差异蛋白显著富集于氧化还原失衡、HIF-1诱导的缺氧信号通路、及吞噬体功能相关通路；
- 发现蛋白Nox2和p22phox可能因氧化应激导致肺损伤。
蛋白-蛋白互作网络分析
- 对脑组织的差异蛋白网络显示，STAT1、FGA和C4b是关键节点；
- 肺组织的差异蛋白网络表明STAT1也是唯一关键驱动蛋白，显示其对病毒病理机制具有重要作用。
实验验证
- Western blot结果显示脑组织中STAT1、TRIM25和ISG15等重要蛋白表达变化与质谱结果一致；
- 肺组织的CDKN1b和Nox2表达验证亦支持质谱分析。
研究结论及重要意义
本研究首次利用动物模型，从分子水平全面揭示了EV71感染的小鼠脑和肺组织的病理特征，主要结论如下： - EV71感染可通过免疫活化、补体与凝血功能失调、血小板激活等机制导致组织损伤； - 氮代谢失衡及肺部缺氧可能是其诱发严重手足口病呼吸道和神经系统并发症的重要环节； - PPI网络指示的关键蛋白STAT1可能成为治疗EV71感染的新靶标。
本研究的应用意义体现在为EV71疫苗与治疗药物的研发提供了全新的分子靶点，同时也为理解HFMD相关的脑炎和肺水肿病理机制打开了新的思路。
研究亮点与创新之处
- 基于定量蛋白质组学的深入分析，以揭示病毒感染后的分子事件；
- 发现了多条关键的信号通路和驱动蛋白，重点强调了如补体-凝血级联和HIF-1相关缺氧信号的独特作用；
- 提出免疫与氧化应激在组织病变中的双重作用，整合了新的研究视角。
该研究为EV71及其相关疾病的分子机制研究做出了重要贡献，其学术价值与实践推广意义均非常显著。