关于治疗性蛋白光诱导修饰的质谱表征研究学术报告

一、 研究团队与发表信息

本研究由来自Amgen Inc. 的Zhongqi Zhang（通讯作者）、Sih-Yao Chow、Ronandro de Guzman、Nathan H. Joh、Marisa K. Joubert、Jason Richardson、Bhavana Shah、Mats Wikström、Jette Wypych，以及来自Northeastern University 的Zhaohui Sunny Zhou共同完成。研究成果以题为《A Mass Spectrometric Characterization of Light-Induced Modifications in Therapeutic Proteins》的论文形式，于2022年2月12日在线发表于Journal of Pharmaceutical Sciences 期刊第111卷。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于生物制药领域，聚焦于治疗性蛋白质药物的质量属性表征。在生物药的开发与生产过程中，确保产品的质量、安全性和有效性至关重要。治疗性蛋白质的“质量属性”包括其翻译后修饰以及生产/储存过程中可能引入的修饰。其中，光诱导修饰是蛋白质在生产和储存期间可能发生的关键降解途径之一，可能影响药物的稳定性、效价和免疫原性。国际人用药品注册技术协调会（ICH）的指导原则也要求对药物进行光稳定性研究。

目前，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）肽图分析是表征蛋白质一级结构修饰的主流技术。然而，从海量的质谱数据中准确提取和量化特定修饰信息，前提是分析者必须“知道要寻找什么”，即预先了解所有潜在的修饰类型。尽管已有文献报道了一些常见的光诱导氧化修饰（如甲硫氨酸、色氨酸的单氧化和双氧化），但可能存在许多尚未被充分认识或报道的修饰。这些“未知”的修饰如果在关键质量区域（如抗体的互补决定区）发生，可能对药物活性产生重大影响，若在常规分析中被遗漏，则构成潜在风险。

因此，本研究的核心目的是：通过系统的光照射实验结合高分辨率质谱分析，全面鉴定和表征治疗性蛋白质在各种光照条件下（包括有无光敏剂存在）可能产生的一系列光诱导化学修饰，建立一个详尽的修饰数据库，从而为生物制药行业常规表征治疗性蛋白的光降解产物提供关键信息和参考依据。

三、 详细研究流程

本研究是一个系统的、多步骤的探索性分析工作，其工作流程可概括为：样品制备与光应激处理 -> 自动化酶解与LC-MS/MS分析 -> 数据自动化处理与修饰鉴定 -> 结果验证与归纳。

1. 研究材料与光照射实验设计：

   • 研究材料： 研究使用了九种不同的重组治疗性蛋白，涵盖多种分子形式，包括1种IgG1单克隆抗体（mAb）、4种IgG-scFv（免疫球蛋白G融合单链可变片段）双特异性抗体、1种IgG-Fab（免疫球蛋白G融合抗原结合片段）双特异性抗体以及3种BiTE®-scFc（双特异性T细胞衔接器融合单链可结晶片段）分子。所有蛋白均在CHO细胞中表达并纯化。这种多样化的蛋白样本选择增强了研究结果的普遍性和参考价值。
   • 实验设计： 研究共设计了四个独立的光照射实验，每个实验均设置未经光照的对照样品。实验条件经过精心设计以产生足够用于发现和结构解析的降解产物：
     • 实验1（高强度UV）： 对一种IgG1 mAb进行320-400 nm紫外线照射，强度为30 W/m²，总曝光量高达4800 W·h/m²（最长160小时），远超ICH指南建议的最低限度（200 W·h/m²），目的是在无光敏剂条件下最大化产生修饰。
     • 实验2（环境光+光敏剂）： 对4种双特异性抗体（3种IgG-scFv，1种IgG-Fab）在1000 lux环境光下照射17小时，并添加6 mM核黄素作为光敏剂。核黄素是哺乳动物细胞培养中常用的维生素成分，此条件模拟了生产过程中可能的敏化条件。
     • 实验3（环境光 ± 光敏剂）： 对3种BiTE®-scFc分子在1000 lux环境光下照射16小时，分别设置含有6 mM核黄素和不含核黄素的组，以直接评估光敏剂的作用。
     • 实验4（环境光+光敏剂，后续纯化）： 对一种IgG-scFv在1000 lux环境光下照射16小时并添加核黄素，之后通过尺寸排阻色谱去除光照产生的高分子量聚集体，分析单体部分的光化学修饰。

2. 样品处理与质谱分析流程：

   • 自动化在线酶解-LC-MS/MS系统： 本研究采用了一个关键的自动化在线胰蛋白酶消化系统。该系统集成在Agilent 1290-II UHPLC上，能够全自动执行蛋白质变性、还原/烷基化（使用TCEP和碘乙酸盐）、缓冲液置换、胰蛋白酶消化以及LC-MS/MS分析。该方法的新颖性与优势在于整个样品制备过程在黑暗中进行，完全避免了人工操作过程中可能引入的人工光诱导修饰，确保了数据的真实性。
   • 色谱与质谱条件： 酶解后的肽段使用反相色谱柱进行分离，采用梯度洗脱。质谱数据在Q Exactive Biopharma高分辨率轨道阱质谱仪上采集，采用数据依赖型采集模式，先进行一级全扫描，再对前6个强度最高的离子进行二级碎裂扫描。

3. 数据分析流程：

   • 核心软件工具： 所有质谱数据均使用内部开发的定制软件 MassAnalyzer（该软件现已集成于Thermo Fisher Scientific的Biopharma Finder平台）进行处理。该软件的一个关键功能是能够进行“无限制修饰搜索”。
   • 数据分析步骤：
     1. 组分检测与峰对齐： 软件首先从总离子流图中检测色谱峰，并进行保留时间对齐。
     2. 肽段鉴定： 通过将实验获得的MS/MS谱图与理论预测的（包括未修饰和已知/未知修饰的）肽段碎片谱图进行比对，实现肽段鉴定。当软件检测到用户未预先提供的修饰时，它会给出该修饰引起的质量数变化（Δmass）及其在肽段上的可能位置。
     3. 修饰验证与定量： 初步鉴定后，研究者对每个修饰的MS/MS谱图进行仔细的人工检查以确认鉴定结果。每个修饰的相对丰度通过修饰肽段的峰面积占该肽段（修饰型与未修饰型）总峰面积的比例来计算。
     4. 相关性分析与修饰鉴定： 计算所有检测到的修饰的丰度后，将其丰度与光照水平进行关联。丰度随光照暴露量增加而增加的修饰被确定为光诱导修饰。随后，研究者利用精确的质量数变化来确定引起该变化的元素组成，并通过解析MS/MS谱图来确定修饰的确切位点。

四、 主要研究结果

研究通过上述系统性的分析，鉴定出了一系列广泛的光诱导修饰，主要发生在含硫氨基酸和芳香族氨基酸的侧链上，包括甲硫氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。

1. 甲硫氨酸的修饰： 除了常见的单氧化（+15.9949 Da，生成亚砜）和双氧化（+31.9898 Da，生成砜）外，还观察到氧化后伴随CH₄S丢失（-32.0085 Da）以及进一步丢失H₂O（-50.0190 Da）的修饰。通过MS/MS碎片模式分析（如特定y离子缺失），研究者提出后两种修饰可能并非简单的醛基结构，而是形成了环状结构（如羟基-γ-内酰胺及其互变异构体），这为理解甲硫氨酸深度氧化产物提供了新见解。

2. 色氨酸的修饰： 鉴定出的修饰非常多样，包括单氧化、双氧化、转化为犬尿氨酸（+3.9949 Da）和羟基犬尿氨酸（+19.9898 Da）等已知修饰。此外，还发现了许多此前在治疗性蛋白中未被充分报道的修饰，例如：双氧化后丢失C₆H₅N（-59.0524 Da）、三氧化（+47.9847 Da）、三氧化后丢失H₂O（+29.9742 Da）或C₆H₅N（-43.0575 Da）、以及转化为天冬氨酸（-71.0524 Da）。研究特别指出，色氨酸氧化会产生多种同分异构体，它们在色谱上具有不同的保留时间，有时碎片模式也不同，这对实现可靠的属性定量提出了挑战，也说明了全面鉴定的必要性。

3. 组氨酸的修饰： 组氨酸的修饰种类尤为复杂。研究发现，常见的单氧化（+16 Da）丰度并未随光照显著增加，可能因其不稳定或迅速转化为其他产物。而双氧化（+31.9898 Da）及其脱水形式（+13.9793 Da）则被广泛检测到。此外，还鉴定出多种罕见或新报道的修饰，如双氧化丢失2个H₂O（-4.0313 Da）、双氧化伴随HCN加合（+4.9789 Da）、双氧化伴随H₂O加合（+50.0004 Da）、转化为天冬酰胺（-23.0160 Da）或天冬氨酸（-22.0320 Da）、以及双氧化丢失CH₂N₂（-10.0320 Da）等。值得注意的是，+50 Da的物种在碰撞诱导解离时极易丢失一个或两个水分子，产生+32 Da和+14 Da的碎片离子，这提示在分析时需要谨慎区分溶液中的真实产物与气相碎片。

4. 半胱氨酸的修饰： 观察到单氧化（次磺酸）、双氧化（亚磺酸）和三氧化（磺酸）。此外，还包括半胱氨酸转变为丙氨酸（-31.9721 Da）、转变为丝氨酸（-15.9772 Da）、丢失H₂S生成脱氢丙氨酸（-33.9877 Da）以及S-乙酰化（+42.0106 Da）等修饰。

5. 酪氨酸和苯丙氨酸的修饰： 主要检测到酪氨酸的氧化（+15.9949 Da）和硝化（+44.9851 Da），以及苯丙氨酸的氧化（+15.9949 Da）。这些修饰的丰度相对较低。

6. 光敏剂的关键作用： 实验结果清晰表明，核黄素作为光敏剂在可见光诱导的蛋白修饰中起着至关重要的作用。在实验3中，没有核黄素存在时，环境光照仅引起可忽略不计的修饰（除极低水平的甲硫氨酸氧化外）。而添加核黄素后，多种修饰的丰度显著增加。这说明蛋白质本身对可见光的吸收有限，光敏剂通过吸收光能产生活性氧物种，是导致可见光下蛋白质降解的主要机制。这一发现对理解生产过程中培养基成分（如核黄素）对产品光稳定性的潜在影响具有重要意义。

7. 修饰位点确定的辅助信息： 研究总结了一些特征性的中性丢失，有助于从MS/MS谱图中识别特定修饰，例如：氧化甲硫氨酸会丢失CH₄SO（63.9983 Da），氧化组氨酸和色氨酸的某些产物易丢失H₂O，而半胱氨酸亚磺酸会丢失H₂SO₂（65.9776 Da）。此外，大多数氧化修饰使肽段更亲水，导致其在反相色谱中洗脱时间提前，而组氨酸修饰因其碱性侧链电荷的丢失，通常导致洗脱时间延后，这为初步判断修饰类型提供了色谱行为上的线索。

五、 研究结论与价值

本研究通过系统的光应激实验和高分辨率质谱分析，首次在治疗性蛋白质上全面、详细地表征了一系列光诱导化学修饰，构建了一个包含多种已知和前所未报修饰的“数据库”。这些修饰主要发生在甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基上。

研究的科学价值在于深化了对治疗性蛋白光化学降解复杂途径的理解，揭示了超出常规监控范围的潜在降解产物，特别是组氨酸和色氨酸上复杂的氧化化学。提出的某些修饰可能形成的环状结构等新见解，丰富了蛋白质氧化化学的基础知识。

其应用价值尤为突出：为生物制药行业的质量控制和分析开发提供了直接、实用的参考工具。基于此修饰列表，科学家和工程师可以在开发LC-MS/MS肽图分析方法时，有针对性地搜索和监控这些潜在的光降解产物，确保对治疗性蛋白关键质量属性的全面表征。这对于评估生产工艺和储存条件的光敏感性、制定合理的避光策略、以及确保最终药品的稳定性和安全性具有重要指导意义。

六、 研究亮点

1. 全面的修饰图谱： 研究超越了常见的单/双氧化修饰，系统性地鉴定并报道了大量在治疗性蛋白光降解研究中未被充分认识或从未报道的化学修饰，特别是组氨酸和色氨酸的复杂氧化产物。
2. 严谨的实验设计： 采用多种蛋白形式、不同光照条件（UV vs. 可见光）、以及有/无光敏剂的对照实验，全面模拟了不同场景下的光降解，结论更具普遍性和说服力。
3. 先进的技术方法： 采用全自动在线酶解-LC-MS/MS系统，有效避免了样品处理过程中的人工修饰引入，保证了数据质量。利用具备“无限制修饰搜索”功能的定制化软件MassAnalyzer进行数据挖掘，是发现新修饰的关键技术支撑。
4. 机制与应用结合： 不仅停留在修饰的鉴定，还探讨了部分修饰的可能结构，阐述了光敏剂（核黄素）在可见光降解中的核心作用，并将基础发现与生物制药工艺开发和质量控制的实际需求紧密联系起来。
5. 强调同分异构现象： 明确指出许多光氧化产物存在多种同分异构体，这对基于质谱的精准定量提出了重要警示，也是方法开发中需要考虑的关键点。

七、 其他有价值的说明

作者在讨论中特别指出，本研究所采用的光照条件是严苛的应激条件（尤其是实验1的超高UV剂量和实验2-4中使用的高浓度核黄素），远超正常生产和储存中可能遇到的情况。因此，文中报告的许多修饰类型和程度在上市药品中很可能不会出现。这说明了研究的探索性和前瞻性定位：其目的并非预测常规产品中的具体降解水平，而是为识别在极端条件下可能产生、且若位于关键区域（如CDR区）可能具有生物学影响的化学修饰提供指南。这些发现有助于在药物开发早期识别潜在风险，指导处方和工艺开发。同时，光诱导氧化与其他过程（如自由基介导的氧化）存在重叠，因此本研究结果对于更广泛的蛋白质化学稳定性研究也具有参考价值。