本文发表于《Immune Network》2016年第16卷第5期，文章标题为《肿瘤细胞上膜结合型IL-12 p35亚基在诱导抗肿瘤免疫方面与膜结合型异二聚体单链IL-12功能相当》。研究由韩国忠南国立大学生物化学系和生物技术研究所的Hyun-Jin Kim、Sang Min Park、Hayyoung Lee和Young Sang Kim共同完成，通讯作者为Young Sang Kim和Hayyoung Lee。该研究属于肿瘤免疫治疗与细胞因子基因治疗领域，主要探讨膜结合型白介素-12（interleukin-12，IL-12）不同表达形式在肿瘤细胞疫苗中的抗肿瘤免疫效果。
IL-12是一种由p35和p40两个亚基组成的异二聚体细胞因子，主要由吞噬细胞、B细胞和其他抗原呈递细胞产生。已有研究表明，重组IL-12在小鼠肿瘤模型和人类临床研究中表现出显著的抗肿瘤效果，但由于其在体内或癌症患者中具有明显的细胞毒性，限制了直接应用。为降低全身毒性并实现局部递送，研究者转向细胞因子基因治疗和DNA疫苗策略。本文研究团队在前期工作中尝试将细胞因子表达于肿瘤细胞膜表面，设想膜结合型细胞因子能够通过邻分泌效应选择性地激活肿瘤抗原特异性效应细胞，增强抗肿瘤免疫。前期研究意外发现，仅表达膜结合型p35亚基的肿瘤细胞克隆即可诱导抗肿瘤免疫，推测其机制可能是肿瘤细胞表面膜结合型p35与体内过量产生的内源性p40亚基结合，形成具有功能的异二聚体IL-12。为进一步验证膜结合型p35是否足以达到完整异二聚体IL-12的抗肿瘤效果，本研究构建并比较了膜结合型IL-12 p35亚基（membrane-bound form of IL-12 p35，mbIL-12p35）与膜结合型单链异二聚体IL-12（membrane-bound form of single chain IL-12，mb-scIL-12）两种肿瘤细胞克隆在诱导抗肿瘤免疫方面的差异。
在实验流程方面，本研究首先构建了mbIL-12p35和mb-scIL-12的表达载体。mbIL-12p35嵌合DNA包含225 bp的肿瘤坏死因子α（TNF-α）cDNA片段，该片段编码细胞质区、跨膜区和胞外区，并连接IL-12 p35全长序列。mb-scIL-12则采用II型跨膜蛋白构建策略，在TNF-α跨膜区后依次连接IL-12 p40全长序列、柔性15氨基酸连接序列（GGGGS）₃以及IL-12 p35成熟序列。研究使用Metha纤维肉瘤细胞系作为肿瘤模型，该细胞系来源于BALB/c小鼠经3-甲基胆蒽诱导。通过脂质体转染法将表达载体导入Metha细胞，并利用G418进行稳定筛选，获得抗药性克隆。随后通过RT-PCR检测IL-12 mRNA表达，并通过流式细胞术使用抗IL-12 p35单克隆抗体检测细胞表面嵌合蛋白表达情况。在功能验证方面，研究采用刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）活化的小鼠脾细胞增殖实验比较两种膜结合型IL-12的体外生物学活性。具体方法为：从BALB/c小鼠分离脾细胞，用2 μg/ml ConA活化72小时；将稳定转染的Metha肿瘤克隆用50 μg/ml丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）灭活30分钟，然后将5×10⁴个脾细胞与1×10⁴个肿瘤细胞共培养48小时，通过台盼蓝染色计数细胞。肿瘤形成能力实验中，将1×10⁶个活肿瘤细胞皮下注射到同系BALB/c小鼠右胁部，每组5只，监测肿瘤生长和小鼠生存情况。3个月后，对存活小鼠腹腔再次注射1×10⁶个野生型Metha细胞，以评估系统性抗肿瘤免疫记忆的建立。
研究结果显示，RT-PCR检测证实mbIL-12p35和mb-scIL-12在各转染Metha肿瘤细胞中均有明显mRNA表达，但流式细胞术检测到的细胞表面表达信号较弱，仅边际性检测到。在体外脾细胞增殖实验中，mb-scIL-12表达克隆诱导ConA活化脾细胞增殖的能力约为mbIL-12p35克隆的两倍，而mbIL-12p35克隆的刺激效果与外源性重组IL-12（3 ng/ml）相当，说明两种膜结合型IL-12均具有生物学活性，但单链异二聚体形式在体外刺激T细胞增殖方面更强。在体内肿瘤形成能力实验中，注射野生型Metha细胞的小鼠全部快速成瘤并在2个月内死亡；而注射mbIL-12p35或mb-scIL-12肿瘤克隆的小鼠中，每组5只中有4只在3个月内保持无瘤并完全存活。另有1只小鼠虽然形成肿瘤，但肿瘤出现时间明显延迟，第30天时野生型肿瘤平均直径为19.4 mm，mbIL-12p35组为8.4 mm，mb-scIL-12组为10.1 mm。值得注意的是，一旦肿瘤形成，其后续生长速度与是否表达外源IL-12无关。在免疫记忆实验中，所有未经处理的对照组小鼠在腹腔注射野生型Metha细胞后1个月内全部形成肿瘤并死亡，而预先接种过mbIL-12p35或mb-scIL-12肿瘤克隆并存活的小鼠在再次攻击后40天内均保持无瘤状态。这一结果表明，尽管mb-scIL-12在体外诱导脾细胞增殖方面优于mbIL-12p35，但两者在体内抑制肿瘤生长和诱导系统性抗肿瘤免疫记忆方面无显著差异。
研究结论认为，肿瘤细胞表达膜结合型IL-12 p35亚基即可达到与膜结合型异二聚体单链IL-12相当的抗肿瘤免疫效果，提示膜结合型p35亚基策略足以用作肿瘤细胞疫苗开发。这一发现具有重要意义：从科学价值看，它揭示了IL-12家族细胞因子亚基间复杂的功能网络，尤其是p35亚基在抗肿瘤免疫中的潜在独立作用；从应用价值看，仅表达p35亚基的肿瘤疫苗构建相对简单，且可能避免完整IL-12带来的过度炎症反应和全身毒性，为肿瘤免疫治疗提供了新的策略方向。研究还讨论了IL-12家族细胞因子之间的竞争与协同关系，指出p40亚基被IL-12和IL-23共享，而p35亚基被IL-12和IL-35共享，其中IL-23具有抗肿瘤活性，而IL-35则具有免疫抑制和促进肿瘤生长的作用。因此，膜结合型p35在肿瘤微环境中可能与内源性p40结合形成IL-12，也可能与EBI3结合形成IL-35，这种双向可能性提示在设计细胞因子基因治疗策略时需要全面考虑IL-12家族细胞因子的复杂调控网络。本文的亮点在于通过直接对比实验证明膜结合型单一亚基与完整异二聚体在体内抗肿瘤免疫中功能相当，挑战了传统认为必须表达完整异二聚体才能获得最佳抗肿瘤效果的观点，为简化肿瘤细胞疫苗设计提供了实验依据。