本研究的主要作者为Cara Polson、Pratibha Sarkar、Bev Incledon、Vanaja Raguvaran和Russell Grant，研究机构为Lilly Laboratory for Bioanalytical Research，位于加拿大安大略省斯卡伯勒。该论文发表于Journal of Chromatography B，2003年第785卷，页码为263至275。

本研究的学术背景属于生物分析化学领域，具体聚焦于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中的样品前处理环节。在药物研发过程中，血浆样品中的蛋白质会与药物分子发生结合，干扰药物的准确定量，因此需要通过蛋白质沉淀技术破坏蛋白-药物结合并去除血浆蛋白。然而，不同沉淀剂在蛋白质去除效率上存在差异，且残留的内源性组分可能在电喷雾离子化过程中引起离子抑制或离子增强效应，从而影响质谱检测的灵敏度和准确性。此外，生物分析中经常需要将同一方法应用于不同动物种属（犬、大鼠、小鼠和人）的血浆样品，而不同种属血浆成分的差异以及不同批次血浆之间的变异也可能影响沉淀效果。基于上述问题，本研究旨在系统评价四类蛋白质沉淀技术（有机溶剂、酸、盐和金属离子）在血浆中的蛋白质去除效率，并利用柱后灌注LC-MS/MS系统评估不同沉淀剂处理后残留内源性组分对蛋白结合药物的离子化效应，从而为生物分析方法开发提供优化依据。

研究工作主要分为两个实验程序。第一个程序是蛋白质沉淀效率评价。研究选取了七种沉淀剂，分别属于四类沉淀技术：有机溶剂类包括乙腈、乙醇和甲醇；酸类包括三氯乙酸和间磷酸；盐类包括硫酸铵和氯化铝；金属离子类包括硫酸锌与0.5N氢氧化钠的混合溶液。实验对象包括犬、大鼠、小鼠和人血浆，沉淀剂与血浆的体积比设置为0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1和4：1，并在四批人血浆中以2：1的比例考察批间变异。所有样品沉淀后离心，采用紫外分光光度法在280 nm波长下测定上清液中的蛋白质浓度，并通过Layne公式对核酸干扰进行校正。蛋白质沉淀效率的计算公式为：沉淀效率等于（总血浆蛋白减去上清液中剩余蛋白）除以总血浆蛋白再乘以100%。第二个程序是离子化效应评价。研究选用了一种同时含羧酸和亚胺官能团的化合物（化合物A）作为探针分子，该化合物与血浆蛋白结合率超过90%。实验中，将化合物A溶液通过柱后灌注系统以10微升每分钟的流速持续注入流动相中，使质谱检测器获得稳定的基线信号。随后分别注入经不同沉淀剂处理后的血浆上清液和水空白样品，通过比较两者在色谱运行期间信号强度的变化来计算离子化效应。离子化效应的计算公式为：离子化效应百分比等于沉淀血浆上清液的平均信号强度除以水空白上清液的平均信号强度再乘以100%。实验考察了五种流动相体系，包括50：50甲醇：水、70：30甲醇：水、50：50乙腈：水、50：50甲醇：0.1%甲酸以及50：50甲醇：10mM甲酸铵，并比较了人、犬、小鼠和大鼠血浆经乙腈沉淀后在50：50甲醇：水条件下的离子化效应差异。

研究结果首先显示，在蛋白质沉淀效率方面，乙腈、三氯乙酸和硫酸锌在各自动作类别中表现最优。在2：1的沉淀剂与血浆体积比下，乙腈平均去除92%的血浆蛋白，三氯乙酸平均去除91%，硫酸锌平均去除96%，且三者在四种种属血浆中均表现出较高且稳定的沉淀效率。三氯乙酸在低体积比（0.5：1）下即可达到超过90%的沉淀效率，这与其他沉淀剂形成鲜明对比。硫酸锌则需要至少1：1的体积比才能在大多数种属中实现超过90%的沉淀效率。硫酸铵虽然具有约90%的沉淀效率，但所需体积比至少为2.5：1，且其不挥发性盐特性可能污染质谱接口，因此在LC-MS/MS生物分析中应用受限。氯化铝在5%（w/v）浓度下几乎不能有效沉淀血浆蛋白。乙醇和甲醇在2：1体积比下也能达到约90%的沉淀效率，但总体上略逊于乙腈。间磷酸在犬和人血浆中表现良好，但在大鼠和小鼠血浆中产生了混浊的上清液，无法准确进行分光光度测定，且不同人血浆批次间变异较大。批间变异结果显示，三氯乙酸、硫酸锌和乙腈在人血浆五批次测定中相对标准偏差均低于1%，表现出优异的重复性。

在离子化效应评价中，研究发现有机溶剂沉淀剂与纯有机流动相组合时产生了显著的离子抑制效应。以人血浆为例，乙腈沉淀后在50：50甲醇：水条件下离子化效应达到76%，甲醇沉淀后达到85.8%，乙醇沉淀后达到86.3%。这种离子抑制的持续时间通常在0.4至7.7分钟之间。相比之下，酸性沉淀剂如三氯乙酸和间磷酸在相同纯有机流动相条件下不仅没有明显的离子抑制，反而表现出一定程度的离子增强效应，离子化效应值分别为23%和0.3%。当流动相中加入0.1%甲酸后，所有沉淀剂处理后的样品离子化效应均显著降低，乙腈沉淀后的离子化效应从76%降至22.9%，甲醇沉淀后从85.8%降至24%，乙醇沉淀后从86.3%降至22.1%。在50：50甲醇：10mM甲酸铵流动相中，离子化效应虽然进一步降低，但化合物A的信号在10分钟采集窗口内未能恢复到稳定基线状态，说明该流动相条件对化合物A的色谱行为产生了不利影响。种属差异研究显示，乙腈沉淀后，人、犬和小鼠血浆在50：50甲醇：水条件下的离子化效应分别为86.9%、86.5%和92.6%，而大鼠血浆的离子化效应为92.9%，且信号抑制持续贯穿整个10分钟采集窗口，直至12.8分钟才恢复稳态，表明大鼠血浆中可能存在更多的内源性干扰组分。此外，通过比较化合物A在不同流动相体系中的保留时间与离子化效应持续时间，研究发现50：50乙腈：水和70：30甲醇：水条件下，化合物A的保留时间落入离子抑制区域，因此不适合作为初始色谱条件；而50：50甲醇：水或50：50甲醇：0.1%甲酸则能使分析物保留时间避开主要离子化效应区域。

本研究的结论指出，在蛋白质去除效率方面，硫酸锌、乙腈和三氯乙酸是最有效的沉淀剂，且在2：1及更高的沉淀剂与血浆体积比下具有广泛的种属适用性和良好的批间重现性。在离子化效应方面，纯有机流动相与有机沉淀剂联用会产生严重的离子抑制，而酸性沉淀剂或含0.1%甲酸的流动相能够有效克服这种离子化效应。对于化合物A这类在正离子TurboIonSpray LC-MS/MS模式下分析的蛋白结合药物，最优的生物分析方法包括：使用三氯乙酸进行蛋白质沉淀，并配合纯有机溶剂流动相（甲醇：水或乙腈：水）；或者使用任何一种质谱兼容的沉淀剂，并配合甲醇：0.1%甲酸流动相。本研究的意义在于为生物分析实验室提供了同时考虑蛋白质去除效率和离子化效应的沉淀剂选择依据，避免了仅根据沉淀效率单一指标进行方法开发所带来的潜在问题。

本研究的亮点主要体现在三个方面。第一，首次在系统层面比较了四类蛋白质沉淀技术在不同动物种属血浆中的蛋白质去除效率，并专门评估了人血浆批间变异，填补了此前文献中关于种属差异和批间变异数据的空白。第二，将蛋白质沉淀效率评价与柱后灌注离子化效应评价相结合，建立了从样品前处理到质谱检测的完整评价流程，使研究结论更贴近实际生物分析方法开发需求。第三，研究明确指出离子化效应不仅与沉淀剂类型有关，还与流动相组成和血浆种属密切相关，为生物分析方法优化提供了具有操作性的指导原则。