作者与发表信息
本文是一篇综述文章，由Xiaofeng Jiang（蒋晓峰）、Ling Sun（孙玲）、Chengwu Hu（胡成武）、Feijian Zheng（郑飞剑）、Zhengbing Lyu（吕正兵）和Jianzhong Shao（邵建忠）共同撰写。第一作者Xiaofeng Jiang与通讯作者Jianzhong Shao分别来自浙江理工大学生命科学学院和浙江大学生命科学学院，其他作者分别来自浙江理工大学、浙江省家蚕生物反应器与生物医学重点实验室及江苏百英生物科技有限公司。该文于2023年9月16日发表于期刊《Marine Drugs》第21卷第496期，文章标题为《Shark IgNAR: The Next Broad Application Antibody in Clinical Diagnoses and Tumor Therapies?》。
论文主题与核心观点
本文系统综述了鲨鱼来源的免疫球蛋白新抗原受体（immunoglobulin new antigen receptor，IgNAR）及其可变结构域（variable new antigen receptor，VNAR）在临床诊断和抗肿瘤治疗中的研究进展与应用前景。文章围绕单域抗体（single-domain antibody，sdAb）相对于传统单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的优势展开论述，重点阐述了鲨鱼VNAR的独特结构特征、生化特性、制备方法及其在临床前研究中的多重应用潜力。
主要观点一：传统单克隆抗体存在多重局限性，亟需新型抗体分子替代
文章首先指出，尽管传统IgG型单克隆抗体在临床上已获批的治疗药物市场中占据主导地位，但其固有的生物学局限和经济障碍始终难以克服。哺乳动物IgG作为药物不稳定且无法口服；其分子量约为150–160 kDa，体积庞大，在穿透实体瘤和跨越血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）时常常受阻。由于尺寸限制，mAb在人体内的作用位点仅限于细胞表面分子，难以接近位于蛋白质表面裂隙中的表位（如酶活性位点），导致结合亲和力较弱，组织浸润能力低下。此外，mAb药物生产成本高昂、对温度和湿度敏感，在电力供应不足的发展中国家难以维持最佳性能。在COVID-19疫情期间，SARS-CoV-2病毒快速变异也可能降低传统抗体疗法和疫苗的敏感性。基于这些限制，开发基于新型抗体分子的诊断试剂和治疗药物成为必然需求。
主要观点二：鲨鱼VNAR具有独特的结构优势与卓越的生化稳定性
VNAR来源于软骨鱼类IgNAR的抗原结合可变区。与由两条重链和两条轻链组成的传统IgG不同，IgNAR分子为重链二聚体，每条重链包含五个恒定结构域和一个单一可变结构域VNAR。VNAR分子量仅约12 kDa，是已知最小的天然抗原结合结构域之一。与传统抗体含有六个抗原结合环不同，VNAR仅携带CDR1和CDR3两个互补决定区（complementarity-determining region，CDR），CDR2区域被短链HV2取代，同时具有HV2和HV4两个额外的高变环。为弥补可变区尺寸的减小，VNAR的CDR3区域编码异常长且结构复杂的序列，最长可达100个以上氨基酸残基，具有独特的拓扑结构，能够结合目标抗原中相对隐蔽的表位（如口袋或沟槽），并具备快速穿透能力。VNAR在氨基酸序列上与人抗体可变区仅有25–30%的同源性，但在关键抗原结合功能结构域上具有保守性，且晶体结构显示其与人抗体可变区具有高度相似性。在生化特性方面，VNAR表现出极高的化学稳定性和热稳定性：在含350 mmol/L尿素和1000 mosm/kg渗透盐离子的鲨鱼血液中保持稳定；在85–97°C高温下孵育3小时后仍保持结合活性；在极端pH环境（如胃液pH=5）和富含蛋白酶的小肠环境中孵育1小时无明显降解迹象。此外，VNAR可通过雾化方式直接进入肺部给药，对抗呼吸道病毒尤其有利。
主要观点三：VNAR可通过人源化改造和多种制备策略实现规模化生产
针对体内治疗应用，鲨鱼VNAR需要人源化以限制潜在免疫原性。CDR移植是最直接和广泛使用的人源化方法。Kovalenko等人在2013年成功将抗人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的VNAR结构域中超过60%的非CDR残基转化为人类种系序列，所得分子在保留亲本VNAR抗原结合特异性和亲和力的同时，表现出可忽略的抗原性、高稳定性和高亲和力。在制备策略上，白点竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）因体型小、性情温和、成熟快、易于实验室饲养和免疫而成为制备抗原特异性VNAR的理想模式生物。其基因组、转录组和血浆中首次揭示了IgNAR家族结构的完整染色体构成。在文库构建方面，噬菌体展示（phage display）是目前分离靶抗原的最主流方法，能够将抗体编码基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合，在噬菌体表面展示抗体以筛选抗原识别结合蛋白。经免疫的鲨鱼文库因经历了体内亲和力成熟，通常比半合成文库和天然文库具有更高的亲和力和特异性。在重组表达方面，由于VNAR表面存在亲水残基、缺乏糖基化修饰，易于在大肠杆菌中克隆和表达，产量为2–15 mg/L，成本远低于传统单克隆抗体生产。
主要观点四：VNAR在临床前研究中展现出广泛的应用潜力，尤其在抗肿瘤领域
在药物开发方面，目前全球有三家公司从事鲨鱼抗体药物研发：Ossianix、Elasmogen和Adalta。其中Adalta开发的AD-214是唯一已进入临床实践的鲨鱼VNAR相关药物，其特异性结合CXCR4，用于治疗特发性肺纤维化，已完成I期静脉给药安全性研究。在COVID-19研究中，多个团队报道了VNAR对SARS-CoV-2受体结合域（receptor-binding domain，RBD）表现出皮摩尔级亲和力和广谱中和活性，且病毒突变几乎不影响VNAR的亲和力。晶体学分析显示VNAR识别RBD上不同于传统mAb的表位，具有独特的病毒中和机制。鼻内给药VNAR可有效保护小鼠免受SARS-CoV-2攻击。在酶抑制剂应用中，针对Aurora-A激酶的VNAR能够通过破坏盐桥、改变构象而使酶失活。在跨血脑屏障递药方面，靶向TfR1的VNAR穿梭蛋白能有效穿越BBB并在生理相关浓度下递送至脑实质，系统给药可防止神经元丢失。在肿瘤治疗中，VNAR凭借小尺寸和高抗原结合亲和力能够有效穿透实体瘤。针对PD-L1免疫检查点的VNAR可阻断PD-1/PD-L1相互作用、增强T细胞受体信号通路并杀伤肿瘤细胞；二价和三价sdAb的活性分别是单价单域抗体的313倍和135倍。利用酵母展示和FACS筛选获得的抗淋巴瘤VNAR-Fc融合蛋白结合常数在低个位数纳摩尔范围内，生成的VNAR抗体-药物偶联物在约20 pM至1 μM的低浓度下即可诱导淋巴瘤细胞特异性杀伤，而无显著细胞毒性。
论文的意义与价值
本文的学术价值在于系统梳理了鲨鱼IgNAR/VNAR从结构特征、生化特性、人源化改造、制备策略到临床前应用的完整知识体系，为后续研究提供了全面参考。其应用价值在于明确指出VNAR作为下一代抗体药物候选分子的可行性：其小尺寸、高热稳定性、强组织穿透力、低生产成本以及可通过雾化给药等多重优势，使其在实体瘤治疗、中枢神经系统疾病治疗、传染病防控及免疫诊断等领域具有广泛前景。文章还强调，尽管鲨鱼来源的sdAb临床转化进展较慢，但VNAR结构域的独特特性和对靶抗原的高亲和力使其有望成为有效的抗原结合治疗药物，进一步开发VNAR抗体药物可能改变生物制剂的未来格局。