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研究报告：利用个体化循环肿瘤DNA监测上尿路尿路上皮癌的术后复发
一、 研究概况与发表信息
本研究由来自岩手医科大学医学院泌尿外科（Department of Urology, Iwate Medical University School of Medicine）的Daichi Tamura和Wataru Obara等人主导，联合了该校生物医学科学研究所（Division of Biomedical Research and Development, Iwate Medical University Institute for Biomedical Sciences）、理化学研究所整合医学科学中心（Laboratory for Cancer Genomics, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences）以及东京大学（Department of Computational Biology and Medical Sciences, The University of Tokyo）等多个研究机构共同完成。该研究成果于2023年11月6日被接收，并于2024年发表在学术期刊《Cancer Science》上。
二、 研究背景与目的
上尿路尿路上皮癌（Upper Tract Urothelial Carcinoma, UTUC）是一种起源于肾盂或输尿管的相对罕见的恶性肿瘤，约占所有尿路上皮癌（Urothelial Carcinoma, UC）的5%。对于非转移性UTUC患者，标准治疗方法是根治性肾输尿管切除术（Radical Nephroureterectomy, RNU）。然而，与膀胱尿路上皮癌相比，UTUC在初次诊断时往往分期更晚，且术后复发率较高。目前，临床上用于监测复发的常规方法包括膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查和计算机断层扫描（Computed Tomography, CT）。但这些方法均有其局限性：膀胱镜检查是侵入性的，患者依从性较差；尿脱落细胞学对于UTUC的敏感性很低；而CT则因为检测分辨率的限制，敏感性亦不理想。因此，在UTUC术后管理中，迫切需要建立一种高灵敏度、高特异性的微创生物标志物来检测复发。
尽管术后辅助治疗有望改善局部晚期UTUC的预后，例如抗PD-1抗体纳武利尤单抗（Nivolumab）和以铂类为基础的化疗在临床试验中均显示出疗效，但这些方案并非对所有患者有效。部分患者因术后肾功能损伤无法接受铂类化疗，且纳武利尤单抗对UTUC的效果不如膀胱癌。因此，对UTUC患者实施个体化的术后治疗方案十分必要。
循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA, ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血液和尿液等体液中的游离DNA片段。ctDNA分析已在多种癌症的复发监测中展现出广阔的应用前景，尤其对于UC，由于肿瘤直接暴露于尿液中，通过尿液样本检测ctDNA极具潜力。已有研究报道了ctDNA检测在UTUC中的应用，但其作为术后复发监测生物标志物的价值尚未被系统评估。典型的ctDNA分析方法包括下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）和数字PCR（Digital PCR, dPCR）。NGS虽能进行全面的基因组分析，但其敏感性较低、成本高昂且耗时长。相比之下，dPCR具有高灵敏度、低成本和快速的优点，但其通量有限，仅限于分析已知的特定基因突变。为了克服两者的缺点，该团队此前已在食管癌中建立了“个体化ctDNA监测系统”。因此，本项前瞻性研究的目的是评估利用dPCR进行个体化ctDNA监测作为UTUC围手术期肿瘤复发生物标志物的临床效用。
三、 研究流程与方法
本研究为一项前瞻性研究，纳入了2019年1月至2020年12月期间在岩手医科大学医学院附属医院接受RNU手术的23例确诊UTUC患者。研究流程主要分为三个核心步骤：肿瘤组织的基因组分析、个体化监测位点的筛选与验证、以及围手术期ctDNA的动态监测。
第一步，样本收集与全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）及TERT启动子测序。研究人员首先收集患者手术切除的新鲜冰冻肿瘤组织及术前外周血中分离的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs），分别提取DNA。随后，对所有肿瘤组织DNA与对应PBMC的DNA进行WES，以全面鉴定肿瘤组织中的体细胞突变。此外，还针对TERT启动子（TERTp）区域进行了靶向扩增子测序。这一关键步骤旨在为每位患者描绘出详尽的肿瘤基因突变图谱。
第二步，个体化监测突变位点的筛选与dPCR探针设计。基于WES和TERTp测序数据，研究人员利用生物信息学流程（Genomon2 pipeline）筛选出每个病例特异的体细胞突变。筛选标准极为严格，旨在排除克隆性造血等干扰，优先选择变异等位基因频率（Variant Allele Frequency, VAF）较高的非同义突变或已知的致病性突变。对于每位患者，最多选择两种突变进行后续的dPCR监测。研究人员拥有一套自主研发的dPCR引物-探针文库，涵盖了常见的突变位点。当患者的特异性突变存在于该文库中时，直接选用；若不在文库内，则根据严格标准定制合成新的dPCR探针。最后，所有病例特异的引物/探针组都必须使用对应的原发性肿瘤DNA进行验证，确保其能准确识别目标突变。
第三步，围手术期ctDNA的纵向监测。研究团队在RNU术前及术后多个时间点（术后2天、1个月、3个月，之后每3个月一次，持续2年）前瞻性地采集患者的血液和尿液样本，共计获得241个时间点的样本。分别提取血浆和尿液中的游离DNA（Cell-Free DNA, cfDNA），然后使用为每位患者定制的dPCR探针进行ctDNA分析，定量检测其VAF。监测结果将与同期进行的常规临床检查（膀胱镜、尿细胞学、CT）结果进行对比。研究中对ctDNA阳性的判读设定了严格标准，要求样本中检测到2个或以上的阳性反应点，或经重复验证、多时间点比对、多突变证实后可判定为阳性。
四、 主要研究结果
本研究的主要发现包括肿瘤基因突变谱特征、个体化ctDNA监测的可行性，以及ctDNA动态变化与临床结局的关系。
在基因组分析方面，所有患者的平均突变负荷为3.23个突变/Mb，其中一例为高突变病例。最常发生突变的基因为TERT（43%）、KMT2D（35%）、TTN（30%）、FGFR3（26%）和TP53（26%）。值得注意的是，TP53、FGFR3和HRAS的突变在患者中是互斥的。
在个体化监测的可行性上，22例（96%）患者的术前血浆或尿液样本中成功检测到了其病例特异的ctDNA突变，这一比例远高于术前尿脱落细胞学的阳性率（17%）。在尿液ctDNA中检出率（87%）高于血浆ctDNA（48%）。在19例（83%）患者中，病例特异性突变被发现在团队自有的原始探针/文库中。经常被选为监测靶点的基因包括TERT（39%）、FGFR3（26%）、TP53（22%）和HRAS（13%）。这一结果表明，通过这种个体化系统，几乎所有UTUC患者都可以进行术后ctDNA监测。
关于术后复发监测，在10例发生膀胱内复发的患者中，复发时点尿液ctDNA全部为阳性（100%），而同期膀胱镜、尿细胞学和CT的阳性率分别为100%、60%和30%。更关键的是，尿液ctDNA检测到复发的平均提前时间（Lead Time）为60天（范围0-202天），意味着可以比常规检查更早地发现分子水平的复发。在2例发生远处转移的患者中，血浆ctDNA在转移诊断时点也均为阳性。动态观察显示，在未复发的12例患者中，其血浆和尿液ctDNA在术后3个月（常规随访开始时）均已转为阴性，并在整个随访期内持续为阴性。具体的病例分析生动地展示了ctDNA的临床价值：一例患者（Case 17）发生膀胱复发时，尿液ctDNA的VAF值比临床诊断提前98天就开始升高；另一例接受新辅助化疗的患者（Case 23）术后病理分期已达ypT3，但其血浆和尿液ctDNA在术后迅速清零并维持阴性，最终该患者确实未出现复发，提示ctDNA动态变化可精准反映治疗疗效和微小残留病灶状态。
预后分析进一步揭示，RNU术前与术后第2天之间尿液ctDNA的VAF变化率是一个强预后因子。复发组患者该变化率的中位数显著高于无复发组。多因素分析确认，尿液ctDNA的VAF变化率高于-95%是唯一与较短的无复发生存期（Recurrence-Free Survival, RFS）显著相关的独立预后因素，而常规的临床病理因素（包括术前尿细胞学）在多因素分析中均未显示出显著意义。
五、 研究结论与价值
本研究首次前瞻性地评估了基于dPCR的个体化ctDNA监测系统在UTUC术后复发监测中的临床有效性。研究结论认为，UTUC中的肿瘤特异性基因突变可以在术后通过血浆和尿液ctDNA进行纵向监测。个体化ctDNA分析是一种极具潜力的微创生物标志物，可用于术后复发的早期检测。
该研究的科学价值在于，它证实了采用“先通过NGS进行肿瘤组织全景式突变分析，再定制dPCR进行高频动态监测”这一策略在UTUC中的可行性和优越性，完美结合了两种技术的优点。在应用价值上，该方法有望改变当前的术后随访模式。与侵入性的膀胱镜和低敏感性的尿细胞学/CT相比，个体化ctDNA监测不仅灵敏度高、可提前预警复发，而且可通过无创的体液检查实现，显著减轻患者痛苦。此外，ctDNA的动态清零可为评估辅助治疗效果、提示是否需要后续强化治疗提供决策依据，有助于真正实现个体化的精准医疗，避免不必要的过度治疗。
六、 研究亮点
本研究具有多个亮点。首先，方法的创新性与实用性：研究建立了一套完整的、可推广的个体化ctDNA监测流程。它利用NGS全面筛查每个肿瘤特有的“分子指纹”，然后将其转化为dPCR可追踪的靶点，这不仅克服了NGS灵敏度低和成本高的问题，也解决了dPCR通量有限的局限性。通过自建的探针文库和对新突变定制探针，使得该方法适用于绝大多数（96%）患者。其次，发现的重要性：研究首次明确了尿液ctDNA在检测UTUC膀胱复发时具有100%的敏感性，并能提供近两个月的提前预警时间，这一发现对临床实践具有直接指导意义。同时，证实了术后早期尿液ctDNA清除率是独立的预后因子，为早期识别高危复发患者提供了全新的分子工具。
七、 局限性
尽管成果显著，但作者也坦诚地指出了研究的局限性。这主要包括单中心研究导致的样本量偏少，特别是发生远处转移的病例较少，可能引起选择偏倚。此外，病例特异性突变与癌症生物学行为之间的深层关系尚不清晰。研究者强调，未来需要更大样本量的多中心研究来进一步确认这些发现，尤其需要验证该方法在监测远处转移方面的价值。