基于二丁基萘胺的近红外荧光探针用于阿尔茨海默病诊疗一体化的研究
作者与发表信息
本研究由香港浸会大学的王学丽、王成科、陈希雅、Iyaswamy Ashok、Senthil Kumar Krishnamoorthi、李敏、李宏瑛（Hung-wing Li）和黄文成（Man-shing Wong）共同完成。研究论文发表于期刊《Talanta》第224卷（2021年），文章编号121830，已于2020年10月30日在线发布。
学术背景
本研究属于生物医学工程与化学生物学的交叉领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）的早期诊断与治疗策略开发。AD是一种与年龄相关的神经退行性疾病，其主要病理特征之一是由淀粉样蛋白-β（Amyloid-β, Aβ）肽聚集形成的淀粉样斑块在脑内沉积。研究表明，在形成不溶性的纤维状斑块之前，可溶性的Aβ寡聚体（oligomers）和单体（monomers）具有更强的神经毒性，它们能引发氧化应激、细胞炎症和神经元损伤，是导致认知功能下降的关键因素。因此，开发能够特异性识别并可视化这些早期、毒性Aβ物种（特别是寡聚体）的工具，并同时能够干预其聚集过程和毒性效应，对于AD的早期诊断和干预治疗具有至关重要的意义。
然而，现有的Aβ成像探针（如基于正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层扫描的放射性探针）常面临成本高、空间分辨率低或涉及放射性物质等问题。近红外（Near Infrared, NIR）荧光成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率和较深的组织穿透性成为一种有吸引力的替代方案。理想的双功能（诊疗一体化，theranostic）Aβ探针应具备以下特性：对Aβ物种（尤其是寡聚体）的高选择性和强结合亲和力；与Aβ结合后产生显著的开/关（turn-on）荧光响应和近红外发射；良好的脂溶性以穿透血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）；低细胞毒性；以及抑制Aβ聚集和相关毒性的能力。
基于此，本研究团队旨在设计并合成一系列新型的、基于二丁基萘胺（dibutylnaphthylamine）供体结构的菁染料（cyanine）荧光探针。这些探针不仅要在体内外实现Aβ物种（特别是寡聚体）的高选择性近红外成像，还要具备抑制Aβ聚集及其诱导的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）生成的神经保护功能，从而成为AD诊疗一体化的潜在工具。
详细工作流程
本研究是一个系统性工作，涵盖了探针的设计合成、光物理性质表征、体外结合与选择性评价、分子对接模拟、治疗潜力评估、血脑屏障渗透性验证以及体内外成像应用等多个步骤。
第一步：探针设计与合成 研究团队设计了三种基于二丁基-2-萘胺供体和喹啉鎓受体的新型菁染料分子，分别命名为DBAN-SLM、DBAN-OSLM和DBAN-SLOH。设计核心是构建强供体-受体结构，以获得近红外发射。引入二丁基旨在增强分子的脂溶性，以促进其穿透血脑屏障。具体合成路线通过补充材料展示，所得产物均通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）和高分辨率质谱（HRMS）进行了充分的结构表征和确认。
第二步：光物理性质及与Aβ结合特性研究 首先，在多种溶剂中测试了三种染料的光物理性质。结果显示，它们均表现出强烈的溶剂化显色效应，发射波长范围从615 nm至816 nm。在磷酸盐缓冲液中，它们的发射波长在604-615 nm之间，但荧光量子产率很低（0.01-0.02）。关键的发现是，当这些探针与不同形态的Aβ物种（单体、寡聚体、原纤维/纤维）结合时，其发射光谱发生了显著的红移（bathochromic shift），最大发射波长移至650-685 nm区间，进入了近红外窗口。这与该团队先前报道的咔唑类染料结合后发生蓝移的现象截然不同。 进一步，研究测量了探针与Aβ结合的荧光增强倍数。以DBAN-SLM为例，与Aβ1-40和Aβ1-42物种结合后，荧光强度分别增强了40-103倍和51-126倍。值得注意的是，荧光增强的幅度因Aβ形态而异，总体趋势是与寡聚体和单体结合时的增强效果远强于与纤维结合的效果，这初步提示了探针对Aβ寡聚体和单体的选择性。通过荧光滴定实验测定了结合解离常数（Kd），结果证实DBAN-SLM和DBAN-OSLM对Aβ物种的结合亲和力强于DBAN-SLOH，且对所有探针而言，其对寡聚体和单体的亲和力均显著高于对纤维的亲和力。选择性实验表明，DBAN-SLM对Aβ1-42寡聚体具有高选择性，其他生物活性小分子和金属离子的干扰很小。此外，探针表现出良好的光稳定性。
第三步：结构与亲和力关系分析（分子动力学模拟） 为了从分子层面理解DBAN-SLM对不同Aβ形态的选择性结合机制，研究团队进行了分子对接和分子动力学模拟。首先通过量子化学计算优化了DBAN-SLM的分子结构。随后，分别将其与Aβ1-42单体、Aβ1-40三聚体（寡聚体模型）和Aβ1-42纤维结构模型进行对接模拟。模拟结果显示：1）与单体结合时，DBAN-SLM的喹啉环和萘环分别与Aβ单体的Leu17和Phe20残基发生相互作用。2）与寡聚体模型结合时，DBAN-SLM能够“陷入”由寡聚体特有的F19和V36残基形成的疏水口袋中，形成稳定的复合物结构。3）与纤维结合时，DBAN-SLM仅能结合在纤维表面S形单体单元的外侧，结合方式类似于与单体的结合，但无法进入类似寡聚体的疏水口袋。这些模拟结果合理解释了实验观察到的现象：对寡聚体的高选择性和强荧光增强源于其独特的疏水口袋“包埋”效应；与纤维较弱的结合则导致了相对较低的荧光响应。
第四步：治疗潜力评估（体外细胞实验） 此部分旨在评估新染料作为Aβ聚集抑制剂和神经保护剂的潜力。首先，使用硫黄素T（ThT）荧光实验评估了染料抑制Aβ1-42聚集的能力。结果表明，所有三种萘胺基菁染料都能有效抑制Aβ1-42的聚集和原纤维形成。接着，通过MTT法评估了染料对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的细胞毒性。结果显示，三种染料的半数致死浓度（LC50）在186 μM至大于200 μM之间，表明它们具有较低的细胞毒性，且比先前报道的苯胺类菁染料的毒性更低。随后，评估了染料的神经保护作用。当SH-SY5Y细胞与Aβ1-42物种共孵育时，细胞活力显著下降；而如果同时加入这三种染料，Aβ诱导的毒性效应被显著减弱。最后，研究检测了染料抑制Aβ诱导的ROS生成的能力。结果显示，在Aβ1-42物种存在下，SH-SY5Y细胞内ROS水平显著升高；而与染料共处理后，ROS的生成量降低了50-60%。这些结果表明，这些染料不仅能够抑制Aβ聚集，还能有效保护神经元免受Aβ诱导的氧化损伤和毒性。
第五步：血脑屏障渗透性与体内成像 为了应用于活体脑部成像，探针必须具备良好的BBB穿透能力。首先通过在线计算工具预测了染料的脂水分配系数（Log P），DBAN-SLM和DBAN-OSLM的预测值（3.44-4.10）在已知易于穿透BBB的分子范围内（2.0-3.5）。随后，将每种染料通过尾静脉注射到12月龄的5xFAD转基因（AD模型）小鼠和同龄野生型（WT）小鼠体内。体内荧光成像显示：注射DBAN-SLM后，在转基因和野生型小鼠的脑部均能检测到清晰的荧光信号，且在转基因小鼠脑部的信号强度显著高于、持续时间长于野生型小鼠。相比之下，DBAN-SLOH处理的脑部几乎无信号，DBAN-OSLM的信号则很弱。这表明DBAN-SLM具有良好的BBB穿透能力，并且其信号增强与转基因小鼠脑内存在的Aβ沉积密切相关。
第六步：离体组织染色验证靶向性 为了进一步确认DBAN-SLM在脑组织中对Aβ物种的靶向能力，对注射了DBAN-SLM的5xFAD转基因小鼠的脑切片进行了共定位染色研究。首先，使用经典的Aβ斑块染料硫黄素S（ThS）进行共染色，结果显示DBAN-SLM的红色荧光簇与ThS的绿色荧光斑块高度重叠，证实了其对Aβ斑块的靶向性。接着，使用不同的Aβ抗体进行共染色：包括寡聚体特异性抗体A11，以及能识别所有Aβ物种的单体/全长抗体6E10和4G8。结果显示，DBAN-SLM的染色信号与A11、6E10和4G8抗体信号均能很好地共定位，证明DBAN-SLM不仅能识别成熟的斑块，还能与可溶性的Aβ寡聚体和单体结合，具有广泛的Aβ物种靶向能力。此外，通过光谱扫描确认，在脑切片上DBAN-SLM结合Aβ斑块后的发射峰值位于680 nm，确属近红外发射。
主要结果
结论与价值
本研究成功开发了一类新型的基于二丁基萘胺的菁染料近红外荧光探针，其中DBAN-SLM被证明是一个极具潜力的AD诊疗一体化候选分子。
科学价值：首先，研究首次系统性地将二丁基萘胺结构单元作为核心供体用于构建Aβ靶向探针，并通过实验和理论模拟证明该结构能赋予探针独特的Aβ寡聚体选择性和结合后近红外发射的特性，这为未来设计靶向蛋白质寡聚体的荧光探针提供了新的结构蓝图和设计思路。其次，研究完整地展示了一种诊疗一体化探针从分子设计、体外功能验证到最终活体成像应用的研发流程，为同类研究提供了范本。最后，分子动力学模拟深入揭示了探针与不同Aβ形态相互作用的微观机制，加深了对探针-靶点相互作用的理解。
应用价值：DBAN-SLM集成了早期诊断和治疗干预的双重功能。在诊断方面，它可作为近红外荧光成像探针，用于AD动物模型的在体、实时、无创脑部Aβ成像，特别是对早期和毒性更强的寡聚体进行可视化，有助于疾病的早期发现和病程监测。在治疗方面，其抑制Aβ聚集和ROS生成的能力，为开发AD的神经保护疗法提供了新的先导化合物。因此，DBAN-SLM有望发展成为一款实用的诊疗一体化工具，服务于AD的基础研究和未来临床转化。
研究亮点