本文报告了一项针对急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）耐药机制和治疗新策略的原创性研究。以下将按照学术研究报告的结构对该论文进行全面阐述。
第一，研究作者、机构及发表信息 本研究由邱阳、李颖、柴萌、滑慧铭、王锐、Samuel Waxman和景永魁共同完成。作者单位包括中国沈阳药科大学的辽宁省血液肿瘤靶向药物重点实验室、中药学院，以及美国西奈山伊坎医学院的Tisch癌症研究所血液/肿瘤科。该研究于2023年发表在期刊《Cell Death Discovery》（2023年9卷，第44期）上，文章的DOI为：10.1038/s41420-023-01317-0。
第二，学术研究背景与目的 本研究的核心科学领域是血液肿瘤学，特别是FLT3-ITD突变型AML的靶向治疗耐药机制。FLT3（Fms样酪氨酸激酶3）基因的内部串联重复（Internal Tandem Duplication, ITD）突变在AML患者中发生率约为25%，与不良预后和高复发风险密切相关。目前，已有多种FLT3-ITD抑制剂（如米哚妥林、奎扎替尼、吉瑞替尼、克瑞兰尼、索拉非尼）应用于临床或处于临床试验阶段。尽管这些药物能诱导疾病暂时缓解，但耐药性的产生普遍存在，最终导致疾病复发。
先前的研究提出，耐药可能与FLT3激酶结构域的继发突变有关。然而，能够同时抑制FLT3-ITD和其激酶结构域突变的药物（如吉瑞替尼和克瑞兰尼），其临床疗效与选择性FLT3-ITD抑制剂相似，提示存在不依赖FLT3-ITD本身的信号通路驱动了耐药。研究表明，逃避凋亡是白血病发生和化疗失败的主要原因。FLT3-ITD可通过上调抗凋亡蛋白Mcl-1、抑制促凋亡蛋白Bim和Puma来促进细胞存活。同时，GSK3β作为AKT的主要底物，其失活（磷酸化）与AML不良预后相关，并参与调控Mcl-1的稳定性。基于此，本研究团队提出假设：GSK3β在FLT3-ITD抑制剂诱导的凋亡中起关键作用，而GSK3β的激活失败是导致耐药的核心原因。此外，受体酪氨酸激酶Axl的过表达与多种癌症的耐药相关，其在FLT3-ITD AML耐药中的作用有待阐明。
因此，本研究的主要目标是：1）比较五种临床FLT3-ITD抑制剂诱导凋亡的能力，探究其与GSK3β/Mcl-1信号轴的关系；2）建立索拉非尼耐药细胞模型，解析其耐药机制，特别是Axl信号通路的作用；3）探索克服耐药的新策略，包括联合使用Axl抑制剂或蛋白质翻译抑制剂高三尖杉酯碱（Homoharringtonine, HHT）。
第三，详细研究流程与方法 研究主要包括五个相互关联的实验流程。
流程一：比较FLT3-ITD抑制剂诱导凋亡的能力及其机制。 研究使用两种对FLT3-ITD抑制剂敏感的AML细胞系：MOLM-13和MV4-11。研究人员在5-200 nM的浓度范围内，评估了五种抑制剂（米哚妥林、克瑞兰尼、吉瑞替尼、奎扎替尼、索拉非尼）诱导细胞凋亡的能力，检测方法包括AO/EB（吖啶橙/溴化乙锭）染色和Annexin V/PI（膜联蛋白V/碘化丙啶）流式细胞术。随后，使用50 nM浓度的药物处理细胞，通过蛋白质印迹法（Western Blot）分析下游信号通路蛋白的变化，包括磷酸化FLT3、ERK、AKT、GSK3β，以及凋亡相关蛋白Mcl-1、Bim、cleaved PARP和cleaved caspase-3。为进一步验证GSK3β的作用，研究使用了两种GSK3β化学抑制剂（SB216763和CHIR-99021）以及TPA（佛波醇酯，可激活PKC并磷酸化GSK3β）进行预处理，观察它们对FLT3-ITD抑制剂诱导凋亡和蛋白表达的影响。此外，还使用了Bim的小干扰RNA（siRNA）来探究Bim在凋亡中的作用。
流程二：建立并表征索拉非尼耐药细胞系。 通过对MOLM-13细胞进行持续索拉非尼刺激，建立了耐药亚系MOLM-13/Sor。评估了该细胞系对索拉非尼的生长抑制率（GI50）和凋亡敏感性。为深入解析耐药机制，研究采用了全外显子测序（Whole-Exome Sequencing, WES）以检测FLT3基因的突变，并通过RNA测序（RNA-seq）比较亲本细胞与耐药细胞的基因表达谱差异。对差异表达基因进行了KEGG通路富集分析。同时，通过蛋白质印迹法验证了耐药细胞中关键信号通路蛋白（如Axl、p-Axl、mTOR、p70S6K、FLT3、AKT、GSK3β及其磷酸化形式，以及Mcl-1、Bim）的表达水平变化。
流程三：在耐药细胞中评估其他FLT3抑制剂并探究Axl的作用。 在MOLM-13/Sor细胞中，测试了奎扎替尼、米哚妥林、克瑞兰尼和吉瑞替尼诱导凋亡的能力，并分析了相关信号蛋白的变化。重点考察了Axl抑制剂BGB324单独或与奎扎替尼联用对耐药细胞凋亡的影响，同时也使用了Axl siRNA进行基因沉默实验。此外，在耐药细胞中重复了TPA和GSK3β抑制剂对克瑞兰尼和吉瑞替尼诱导凋亡的干预实验。
流程四：探究细胞因子和白介素-3（IL-3）对凋亡的调节作用。 研究利用了已转染FLT3-ITD或FLT3-TKD的32D细胞系（32D/FLT3-ITD和32D/FLT3-TKD），这些细胞可以在无IL-3的条件下生长。在此模型中，测试了克瑞兰尼和吉瑞替尼诱导凋亡的能力，并观察添加IL-3后对药物诱导的凋亡及相关蛋白（Mcl-1, p-GSK3β）表达的影响。
流程五：评估蛋白质翻译抑制剂HHT的单独及联合治疗效果。 首先测试了HHT单独作用于MOLM-13和MOLM-13/Sor细胞时的凋亡诱导能力及相关蛋白（FLT3-ITD， Axl， Mcl-1）的表达变化。接着，将低剂量的HHT与低剂量的克瑞兰尼或吉瑞替尼联用，评估其协同诱导凋亡的效果。最后，进行了体内动物实验。将MOLM-13/Sor细胞通过尾静脉注射或皮下接种到NOD-SCID免疫缺陷小鼠体内。对于尾静脉接种模型，评估了HHT、吉瑞替尼、克瑞兰尼单药或HHT与吉瑞替尼/克瑞兰尼联用对小鼠生存期的影响。对于皮下接种模型，评估了HHT与吉瑞替尼联用对肿瘤生长的抑制作用，并在治疗结束后通过蛋白质印迹法分析肿瘤组织中的蛋白表达，通过H&E染色检查主要器官的毒性。
数据统计分析： 所有数据均以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism软件进行分析。两组间比较采用Student‘s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
第四，主要研究结果 结果一： 五种FLT3-ITD抑制剂均能抑制FLT3磷酸化并诱导MOLM-13和MV4-11细胞凋亡，但其效力有差异。奎扎替尼在最低浓度（5 nM）下即显示出强效的凋亡诱导作用。凋亡诱导与p-ERK、p-AKT、p-GSK3β水平的降低，以及促凋亡蛋白Bim的上调和抗凋亡蛋白Mcl-1的下调相关。MV4-11细胞比MOLM-13细胞更敏感。
结果二： 使用TPA（可磷酸化并失活GSK3β）或GSK3β化学抑制剂（SB216763， CHIR-99021）预处理，能显著减弱奎扎替尼、索拉非尼、克瑞兰尼、吉瑞替尼诱导的凋亡，同时逆转了药物导致的Mcl-1下调，但不影响Bim的上调。沉默Bim基因并未减弱奎扎替尼诱导的凋亡。这些结果表明，GSK3β激活介导的Mcl-1下调对于FLT3-ITD抑制剂诱导凋亡至关重要，而Bim可能不是该过程中的唯一或关键限制因素。
结果三： 成功建立的索拉非尼耐药细胞系MOLM-13/Sor对索拉非尼的耐药指数高达86.51。WES检测发现其携带FLT3-ITD的继发D835Y点突变。RNA-seq分析显示，耐药细胞中有4490个差异表达基因，KEGG富集分析提示与凋亡、PI3K/AKT、MAPK、mTOR和RAS信号通路相关的基因显著富集。蛋白质印迹证实，与亲本细胞相比，耐药细胞中Axl、p-Axl、FLT3、mTOR、AKT、ERK、GSK3β的磷酸化水平以及Mcl-1蛋白水平均显著升高。
结果四： 在MOLM-13/Sor细胞中，奎扎替尼（50 nM）无法诱导凋亡，而克瑞兰尼和吉瑞替尼仍能有效诱导凋亡。机制上，奎扎替尼能抑制p-FLT3、p-AKT和p-ERK，但不能抑制p-Axl，也未导致PARP切割；而克瑞兰尼和吉瑞替尼能同时抑制p-FLT3和p-Axl，激活GSK3β（降低p-GSK3β），下调Mcl-1，并诱导PARP切割。TPA可上调耐药细胞中p-Axl和p-GSK3β，并阻断克瑞兰尼和吉瑞替尼诱导的凋亡及Mcl-1下调。GSK3β抑制剂同样能阻断这两种药物在耐药细胞中的凋亡诱导作用。Axl抑制剂BGB324或沉默Axl基因，能够与奎扎替尼协同作用，显著诱导耐药细胞凋亡，并伴随Mcl-1的进一步下调。
结果五： 在32D/FLT3-TKD细胞中，克瑞兰尼和吉瑞替尼诱导的凋亡可被外源性添加的IL-3所阻断，同时IL-3也阻止了药物引起的p-GSK3β降低和Mcl-1下调。这提示细胞因子可通过失活GSK3β来介导对FLT3抑制剂的抵抗。
结果六： HHT能有效诱导MOLM-13和MOLM-13/Sor细胞凋亡，并降低FLT3-ITD、Axl和Mcl-1的蛋白水平。低剂量HHT与低剂量克瑞兰尼或吉瑞替尼联用，在体外表现出显著的协同凋亡诱导效应。在MOLM-13/Sor细胞小鼠异种移植模型中，HHT与吉瑞替尼联用能显著延长尾静脉接种小鼠的生存期（ILS为61.3%），并强力抑制皮下移植瘤的生长（抑制率为73.1%），且未观察到明显的器官毒性。肿瘤组织分析显示，联合治疗能协同下调Axl、FLT3-ITD和Mcl-1蛋白，并增强PARP和caspase-3的切割。
第五，研究结论与意义 本研究系统性地阐明了一条在FLT3-ITD AML靶向治疗中起核心作用的信号轴：GSK3β/Mcl-1轴。该轴受到FLT3-ITD、Axl以及细胞因子（如IL-3）的多重调控。
结论一： FLT3-ITD抑制剂诱导凋亡的能力取决于其能否成功激活GSK3β（去磷酸化），进而导致关键抗凋亡蛋白Mcl-1的降解。这是其发挥疗效的关键下游机制。
结论二： 对索拉非尼等抑制剂产生耐药的AML细胞，其耐药机制不仅涉及FLT3的继发突变，更重要的是出现了Axl信号通路的代偿性激活。活化的Axl通过维持GSK3β的磷酸化失活状态和Mcl-1的高表达，从而抵消FLT3抑制带来的促凋亡信号，导致凋亡“逃逸”。这使得细胞对仅靶向FLT3的抑制剂（如奎扎替尼）产生交叉耐药，但对能同时抑制FLT3和Axl的双重抑制剂（如吉瑞替尼、克瑞兰尼）仍保持敏感。
结论三： 蛋白质翻译抑制剂HHT通过降低FLT3-ITD、Axl和Mcl-1等多种关键促存活蛋白的水平，能够克服由多种机制（包括蛋白过度表达）引起的耐药。HHT与吉瑞替尼的联合方案，通过同时打击酶的活性和蛋白质合成这两个层面，在体内外均显示出强大的协同抗白血病效应，为克服FLT3-ITD AML的耐药提供了极具前景的新策略。
科学价值： 本研究深入揭示了FLT3-ITD AML靶向治疗耐药的一个核心统一机制——GSK3β/Mcl-1轴的失调控，并将Axl信号和细胞因子信号整合到该调控网络中，提供了对耐药机制更系统、更深入的理解。
应用价值： 1）为临床使用FLT3抑制剂（尤其是吉瑞替尼这类双重抑制剂）提供了理论依据；2）提出了将Axl作为克服FLT3抑制剂耐药的新靶点；3）创新性地提出并验证了HHT与FLT3/Axl双重抑制剂联用这一极具转化潜力的治疗策略，有望改善难治/复发FLT3-ITD AML患者的预后。
第六，研究亮点 1. 机制研究的系统性与深度： 研究没有局限于单一耐药机制，而是通过构建耐药模型、多组学分析和多层次功能验证，系统揭示了从FLT3/Axl受体到GSK3β激酶，再到Mcl-1效应蛋白的完整信号传导轴，并阐明了其在耐药中的核心枢纽作用。 2. 临床转化的强关联性： 研究直接对比了五种已进入临床应用的FLT3抑制剂，其发现直接解释了不同抑制剂临床疗效差异的可能机制（如吉瑞替尼对索拉非尼耐药患者有效的现象），并使提出的联合治疗方案（HHT+吉瑞替尼）具有明确的临床转化路径。 3. 研究模型的巧妙运用： 不仅使用了常规AML细胞系，还通过建立耐药细胞系、利用转染特定基因的32D细胞模型以及小鼠异种移植模型，从体外到体内，从药物敏感到耐药，全方位验证了科学假设。 4. 提出创新的联合治疗策略： 将传统化疗药物HHT（一种蛋白质翻译抑制剂）与新型靶向药物吉瑞替尼相结合，通过作用于不同的生存依赖环节（蛋白功能与蛋白合成），实现了协同增效，为克服肿瘤异质性和适应性耐药提供了新思路。
第七，其他有价值的发现 研究发现，FLT3-ITD AML细胞（如MOLM-13， MV4-11）的生存高度依赖于Mcl-1，因为直接沉默Mcl-1即可诱导这些细胞凋亡；而在其他类型AML细胞（如THP-1， K562）中则无此效应。这进一步强调了针对Mcl-1（尤其是通过GSK3β调控其稳定性）在FLT3-ITD AML治疗中的特异性和重要性。此外，研究观察到所有FLT3-ITD抑制剂处理都会反馈性地上调Axl蛋白的总量，这可能是肿瘤细胞试图维持生存信号的适应性反应，也提示持续抑制Axl信号或联合蛋白合成抑制剂的重要性。