本研究于2017年10月13日在线发表于*Cell Death and Differentiation*期刊（2018年第25卷353-367页），题为《n6-isopentenyladenosine dual targeting of AMPK and Rab7 prenylation inhibits melanoma growth through the impairment of autophagic flux》。主要作者为Roberta Ranieri、Elena Ciaglia、Giuseppina Amodio、Simona Pisanti和Maurizio Bifulco等人，来自意大利萨莱诺大学医学院与牙科学院（University of Salerno, Scuola Medica Salernitana）、萨莱诺大学药学院、以及意大利国家研究委员会内分泌与实验肿瘤学研究所（CNR-IEOS）等机构。

本研究致力于解决黑色素瘤治疗中的一个关键难题：化疗耐药性。黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌，尤其当发展到转移阶段时预后极差。尽管针对MAPK通路和免疫检查点的靶向治疗取得进展，但耐药性和严重副作用仍是主要障碍。研究表明，许多肿瘤，包括黑色素瘤，存在高水平的保护性自噬，这种自噬促进了肿瘤进展和对化疗的抵抗。因此，靶向自噬过程被认为是极具前景的癌症治疗新策略。在此背景下，研究团队关注到甲羟戊酸途径的终端产物之一——N6-异戊烯基腺苷，前期研究表明IPA具有抗多种肿瘤的活性，并能激活AMPK（AMP依赖的蛋白激酶），但IPA对自噬过程的影响及其在黑色素瘤中的具体作用机制尚不明确。本研究旨在利用体外和体内模型，首次探究IPA是否通过调节自噬发挥其抗黑色素瘤活性，并阐明其分子机制，为开发新的黑色素瘤治疗策略提供临床前依据。

本研究的工作流程系统而严谨，主要可分为分子机制探索、信号通路验证和体内效果确认三大阶段，涉及细胞实验和动物模型。研究对象以人恶性黑色素瘤细胞系A375为主，并在体内实验中使用了SCID小鼠构建异种移植瘤模型。具体实验流程和数据分析如下：

首先，研究团队评估了IPA对黑色素瘤细胞的基本效应。他们通过BrdU掺入法检测细胞增殖，发现IPA在低微摩尔浓度范围内即可时间、剂量依赖性地抑制A375细胞增殖。为确认其活性形式，研究使用了腺苷激酶特异性抑制剂5-ITU进行预处理。结果发现，5-ITU能完全阻断IPA的抗增殖作用，证实了IPA需被ADK磷酸化为5′-单磷酸IPA后才具有活性。长期集落形成实验进一步支持了这一结论。细胞周期分析显示，IPA处理导致细胞停滞在G1期。

其次，研究深入探讨了IPA对自噬过程的影响。鉴于前期发现IPA可激活AMPK，研究首先在黑色素瘤细胞中验证了这一效应。Western blot结果显示，IPA处理24小时后，AMPK在Thr-172位的磷酸化呈剂量依赖性增加，同时其下游底物mTOR的磷酸化被抑制，mTOR的靶蛋白p70S6K的磷酸化也相应降低，表明AMPK/mTOR信号通路被激活。由于AMPK/mTOR通路是自噬的关键调节器，研究随即通过多种方法检测自噬状态。他们通过转染GFP-LC3质粒并进行共聚焦显微镜观察，发现IPA处理导致GFP-LC3斑点（代表自噬体）数量显著增加。Western blot检测自噬标志物LC3，发现脂化的自噬体相关形式LC3-II的时间、剂量依赖性积累。这些现象通常提示自噬被激活。

然而，仅凭自噬体积累不足以区分是自噬流增强还是自噬后期步骤受阻。为了精确测量自噬流，研究采用了多种互补技术。一是检测自噬底物p62/SQSTM1的蛋白水平，p62在自噬体与溶酶体融合后被降解。结果发现，IPA处理反而导致p62积累，这提示自噬流可能被阻断。共聚焦显微镜下观察到p62与GFP-LC3在大斑点中共定位，进一步支持自噬晚期阶段受阻的推测。二是利用一种基于海肾荧光素酶的活细胞LC3周转报告系统。通过比较野生型LC3和无法被脂化的突变型LC3的报告活性比值，可以特异性反映依赖于脂化的自噬性降解。结果显示IPA处理并未导致该比值下降，与已知的自噬抑制剂羟氯喹效果一致，证明自噬流未被诱导。三是使用串联RFP-GFP-LC3报告蛋白。当自噬体与酸性溶酶体融合形成自噬溶酶体时，GFP荧光被淬灭，仅保留RFP信号。IPA处理后，黄色斑点（RFP与GFP共定位，代表未与溶酶体融合的自噬体）增加，而红色斑点（仅RFP，代表自噬溶酶体）和紫色斑点（RFP-LC3与溶酶体标记LAMP-1共定位）减少，直观地证明了自噬体-溶酶体融合过程受损。

第三，研究致力于阐明IPA阻断自噬体-溶酶体融合的机制。首先排除了溶酶体功能本身受损的可能性。使用LysoTracker Red和吖啶橙染色进行流式分析，发现IPA处理增加了酸性囊泡的数量。溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B的活性测定也显示其活性未受抑制，反而有所增加，表明溶酶体的酸化和降解功能正常。因此，融合障碍可能在于运输或对接环节。研究聚焦于小GTP酶Rab7，它是介导晚期自噬体与溶酶体融合的关键蛋白，其膜定位依赖于异戊二烯化修饰。之前的研究表明IPA可抑制法尼基焦磷酸合成酶从而影响蛋白质异戊二烯化。本研究通过电泳迁移变动分析证实，IPA处理导致未异戊二烯化的Rab7积累，而异戊二烯化的形式减少。同时，其他异戊二烯化蛋白标志物如HDJ-2和Rap1a也出现未异戊二烯化形式的积累。共聚焦显微镜观察显示，在IPA处理的细胞中，Rab7呈现胞质内的点状分布，未能与GFP-LC3标记的自噬体或LysoTracker标记的溶酶体有效共定位。相反，使用不影响异戊二烯化的自噬抑制剂羟氯喹处理时，Rab7主要定位在膜上并环绕着GFP-LC3聚集体。这些结果强有力地表明，IPA通过抑制Rab7的异戊二烯化，导致其无法正确定位和发挥功能，从而阻碍了自噬体-溶酶体的融合。

第四，研究探索了自噬流抑制与细胞死亡的关联。通过Annexin V/PI流式细胞术分析，发现IPA能剂量和时间依赖性地诱导A375细胞凋亡，而非坏死。Western blot检测显示，凋亡内在通路被激活：caspase-9在24小时被激活，随后在48小时激活caspase-3并导致PARP蛋白切割。使用5-ITU预处理可阻断AMPK激活、LC3-II积累、p62积累以及细胞凋亡，证明所有这些效应均依赖于IPA被磷酸化为其活性形式IPAMP。

第五，为了厘清AMPK激活与Rab7异戊二烯化抑制在IPA作用中的关系，研究使用了特异性siRNA敲低AMPK α1催化亚基。结果表明，AMPK沉默完全阻断了IPA诱导的细胞凋亡、caspase-3/PARP切割以及组织蛋白酶B的活化。同时，AMPK沉默也阻止了IPA诱导的LC3-II积累和GFP-LC3斑点形成，说明自噬体的积累依赖于AMPK的激活。然而，值得注意的是，在AMPK被敲低的细胞中，IPA处理仍然导致p62积累和Rab7的异戊二烯化被抑制，且Rab7仍保持胞质点状分布。这清晰地证明，IPA对Rab7异戊二烯化的抑制以及对自噬流完成的阻断，是独立于AMPK通路的。

最后，研究在体内模型中验证了IPA的抗肿瘤效果及其机制。将A375细胞皮下接种到SCID小鼠体内建立异种移植瘤模型，通过瘤周注射给予IPA（5或10 mg/kg/天）治疗三周。结果显示，IPA治疗能显著抑制肿瘤生长。对瘤组织进行Western blot分析发现，与体外结果一致，IPA处理增强了AMPK的磷酸化，抑制了mTOR的磷酸化，并导致了未异戊二烯化Rab7的积累，p62水平也呈升高趋势。这些数据在体内证实了IPA通过激活AMPK通路和抑制Rab7异戊二烯化来阻断自噬流，从而发挥抗黑色素瘤活性。

本研究的主要结论是：N6-异戊烯基腺苷是一种新型的自噬双重调节剂，它通过两个独立且协同的机制发挥强大的抗黑色素瘤作用。首先，其活性代谢物IPAMP作为AMP类似物激活AMPK，导致mTOR抑制和自噬体生成增加。其次，IPA同时抑制蛋白质（特别是Rab7）的异戊二烯化，导致未异戊二烯化的Rab7功能丧失，无法介导自噬体与溶酶体的融合，从而阻断了自噬流的完成。这种自噬体积累与降解受阻的“矛盾”状态，最终引发黑色素瘤细胞的凋亡性死亡。AMPK激活对于诱导自噬体积累和启动凋亡是必需的，而对Rab7异戊二烯化的抑制是独立发生的，负责阻断自噬流，二者共同导致了细胞命运的致命转向。

本研究的科学价值和应用价值重大。在科学层面，它首次揭示了IPA作为一种内源性异戊二烯产物对自噬过程的独特双重调控作用，阐明了一个通过同时靶向AMPK激活和Rab7异戊二烯化来精确破坏自噬稳态的新机制。这深化了我们对自噬调控网络复杂性的理解，特别是异戊二烯化修饰在自噬晚期步骤中的关键作用。在应用层面，本研究为黑色素瘤，尤其是那些因保护性自活化而产生耐药的黑色素瘤，提供了一种极具潜力的新型治疗策略。IPA这种能同时诱导自噬体生成并抑制其清除的特性，使其可能作为一种单药或与现有化疗/靶向疗法联用，有效克服肿瘤的耐药性，具有重要的临床转化前景。

本研究的亮点在于：第一，发现了具有新颖作用机制的先导化合物：IPA是首个被报道能通过“双靶点”机制（AMPK和Rab7异戊二烯化）协调调控自噬不同阶段的天然衍生化合物。第二，机制研究系统深入、逻辑严密：研究采用了从细胞增殖、信号通路、自噬流多参数检测（包括p62、串联荧光LC3、活细胞LC3周转报告系统）、蛋白质修饰分析到细胞凋亡评估的完整技术链条，并通过药理学抑制剂（5-ITU）和基因敲低（AMPK siRNA）实验清晰地将AMPK依赖和非依赖的效应区分开来，论证扎实。第三，明确的临床相关性：研究紧密结合黑色素瘤治疗耐药这一临床难题，从基础机制探索到体内药效验证，形成了完整的证据链，为后续开发提供了坚实的临床前依据。第四，对自噬作为治疗靶点的策略提供了新视角：研究表明，同时激活和抑制自噬的不同阶段可能是一种比单纯抑制更有效的抗癌策略，尤其适用于依赖保护性自噬生存的肿瘤。

这项研究不仅首次阐明了IPA通过双重靶向作用破坏自噬流从而抑制黑色素瘤生长的详细机制，也为开发针对自噬过程的新型抗癌疗法提供了重要的概念验证和候选分子。