本研究由Hacettepe University（哈切特佩大学）多个院系的研究团队合作完成，主要作者包括Gökçe Çoban、Esin Akbay Çetin、Çiğdem Kip和Ali Tuncel等人，分别来自化学工程系、生物系、生物工程部和物理工程系。该研究成果发表于*Microchimica Acta*期刊2026年第193卷，文章编号463，于2026年6月10日在线发表。通讯作者为Çiğdem Kip和Ali Tuncel。
纳米酶（nanozyme）是指具有类酶催化活性的纳米材料，在传感检测、抗菌和抗肿瘤治疗领域受到广泛关注。化学动力学疗法（chemodynamic therapy, CDT）利用芬顿或类芬顿反应产生高活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）杀伤肿瘤细胞，但其临床应用受限于肿瘤微环境的低氧特性和催化效率不足。将CDT与光热疗法（photothermal therapy, PTT）整合于同一纳米平台被认为是一种有效的协同策略——光热效应不仅可直接热消融肿瘤细胞，还能通过升温提高催化反应速率和ROS产率。血红蛋白（hemoglobin, Hb）因其固有的生物相容性、可降解性和氧化还原活性，成为构建CDT体系的有前景的金属蛋白骨架；然而现有Hb基治疗剂的合成通常涉及多步骤、长时间的反应流程，有时还需模板材料，限制了其实际应用转化。钌（ruthenium, Ru）功能化治疗剂的研究虽日益增多，但将Hb与Ru前驱体直接结合制备纳米酶的工作极为有限。本研究旨在开发一种简便的一步水热法合成Hb@Ru纳米颗粒（hemoglobin-ruthenium nanoparticles, Hb@Ru NPs），并系统评估其对胶质母细胞瘤和肝癌细胞的协同PTT&CDT治疗效果。
研究首先完成了Hb@Ru NPs的合成与表征。合成采用单阶段水热法，在140 °C条件下以三氯化钌水合物为金属前驱体、Hb为蛋白骨架。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定显示Ru含量为40% w/w，热重分析（TGA）显示干态样品加热至800 °C时失重37.7%，综合判断该纳米颗粒约一半由变性Hb有机组分构成、另一半为Ru组分。动态光散射（DLS）测定表明Hb@Ru NPs的流体动力学众数粒径约10 nm，远小于单纯Hb NPs的227 nm和单纯RuO₂ NPs的676 nm，证明Hb在合成中发挥了有效的稳定剂作用。扫描电镜（SEM）图像分析进一步证实了粒子的小尺寸特征。Zeta电位随pH的变化曲线显示Hb@Ru NPs在研究pH范围内具有可观的表面电荷，源于表面变性Hb氨基酸残基的存在。X射线衍射（XRD）图谱清晰呈现Ru(100)、Ru(101)、Ru(102)、Ru(110)、Ru(201)晶面的衍射峰，确认了结晶态Ru相的存在；由XRD计算所得平均晶粒尺寸为4.7 nm。高分辨透射电镜（HRTEM）图像显示小于10 nm的纳米颗粒，测得晶面间距d-spacing在0.109–0.162 nm之间，选区电子衍射（SAED）图案进一步确认了上述晶面。X射线光电子能谱（XPS）分析揭示了Ru 3p和Ru 3d能级的特征峰，通过去卷积识别出Ru⁰和Ru⁴⁺两种价态共存；O 1s谱中存在Ru-O-Ru、Ru-OH和OH基团的峰，N 1s谱中的C-N=C和C-N基团则来源于Hb分子。
随后研究系统评估了Hb@Ru NPs的纳米酶功能。在1× PBS缓冲液（pH 7.4，37 °C）中测定了类过氧化氢酶（catalase-like, CAT-like）和类过氧化物酶（peroxidase-like, POD-like）活性。对于CAT-like活性，单纯RuO₂ NPs最高，Hb@Ru NPs略低，而单纯Hb NPs几乎无活性，表明Ru是增强CAT-like活性的关键组分。对于POD-like活性，Hb@Ru NPs最高，单纯RuO₂ NPs次之，单纯Hb NPs最低。Hb@Ru NPs的最大底物消耗速率分别为：CAT-like活性107.5 mM mg⁻¹ s⁻¹、POD-like活性6.94 μM mg⁻¹ s⁻¹，均远高于文献报道的同类纳米酶。温度由37 °C升至45 °C时，两种酶活性均显著增强，预示了PTT条件下的催化增强效应。谷胱甘肽（glutathione, GSH）消耗实验显示，单纯RuO₂和Hb@Ru NPs的GSH消耗百分比非常接近，而单纯Hb NPs的消耗较低，再次证明Ru是GSH消耗的控制性组分；0.25 mg mL⁻¹的Hb@Ru NPs浓度即可实现对0.5 mM GSH的几乎完全消耗。值得注意的是，储存稳定性测试表明，在+4 °C下储存171天后，Hb@Ru NPs的酶活性和GSH消耗能力未发生显著变化。
研究进一步考察了Hb@Ru NPs的纳米马达能力。其强CAT-like活性可分解H₂O₂产生O₂气泡，从而驱动纳米颗粒的自推进运动。光学显微镜监测显示，在5 mM H₂O₂存在下，O₂气泡表面区域的Hb@Ru NPs沿径向做对流运动，单个气泡的生长伴随着颗粒的径向迁移。对微团聚体运动轨迹的追踪分析显示其线性速度在65–85 μm/s之间，显著区别于布朗运动。为验证纳米马达功能对细胞互作的影响，研究者将非贴壁T98G细胞分别与含和不含1 mM H₂O₂的培养基中的Hb@Ru NPs共孵育。荧光显微镜观察显示，H₂O₂存在时附着于细胞的黄色微团聚体数量明显增多；吸光度定量分析表明，有H₂O₂时细胞摄取/附着的Hb@Ru NPs量是无H₂O₂时的1.7倍，证实了纳米马达运动对细胞互作的正向贡献。
活性氧生成研究采用电子自旋共振（ESR）光谱和自由基清除实验。ESR谱由七条强度略有差异的共振信号组成，与DMPO-O₂•⁻和DMPO-¹O₂自旋加合物特征一致；模拟计算进一步确认了超氧阴离子（O₂•⁻）和单线态氧（¹O₂）的生成。自由基清除实验显示甲醇对信号无抑制（表明无明显•OH生成），抗坏血酸和硫脲的抑制最为显著（证明O₂•⁻的有效生成），L-组氨酸的抑制中等（说明¹O₂的生成程度较低）。细胞内ROS检测采用DCFDA荧光探针，相对荧光强度顺序为PTT&CDT > PTT > CDT，验证了联合疗法的协同增效。
光热转化实验显示，在808 nm近红外（NIR）激光照射（1.0 W/cm²）下，Hb@Ru NPs浓度从0.05到2.0 mg mL⁻¹变化时，300秒内温度升高幅度为14–29 °C。连续开关激光的加热-冷却循环曲线证明了光热行为的可逆性，计算所得光热转化效率为46.7%，时间常数为128.1秒。Tauc图分析得到带隙能量1.6 eV，与808 nm NIR激光的光子能量（约1.53 eV）匹配良好，解释了其高效光热转化机制。
体外抗肿瘤活性评估是研究的核心环节。细胞毒性测试显示Hb@Ru NPs对L929小鼠成纤维细胞（健康细胞株）和T98G胶质母细胞瘤细胞的活性均未产生显著影响（存活率>90%），表明其在无外加刺激条件下具有良好的细胞相容性。在不同治疗模式下：单独PTT模式在浓度>0.1 mg mL⁻¹时即出现明显细胞死亡；单独CDT模式需浓度>0.5 mg mL⁻¹才能达到显著的细胞杀伤；PTT&CDT联合模式在浓度>0.25 mg mL⁻¹时即产生显著效果。在2.0 mg mL⁻¹浓度下，PTT&CDT联合治疗对T98G细胞实现了高达92.7%的细胞死亡率。流式细胞术分析显示，PTT&CDT联合组的凋亡率为63.32%，明显高于单独CDT组的45.63%和单独PTT组的50.88%。在HepG2人肝癌细胞上的验证实验进一步确认了联合治疗的有效性（细胞存活率最低降至6.0%）。TUNEL染色结果表明，PTT&CDT联合组呈现最高密度和分布的TUNEL阳性细胞，证实了DNA断裂和凋亡的最强诱导效应。细胞划痕（伤口愈合）实验显示，PTT&CDT联合治疗48小时后伤口愈合过程被显著抑制，划痕区域保持大面积开放，结晶紫染色进一步证实了细胞密度降低和细胞间互作减少。细胞周期流式分析表明，单独PTT和单独CDT主要诱导G2/M期阻滞，而PTT&CDT联合治疗则显著增加sub-G1群体（凋亡指标），表明在严重氧化应激和热应激条件下细胞凋亡被增强。
本研究成功开发了一种简便的一步水热法，用于合成含结晶态Ru的Hb@Ru NPs。该纳米平台兼具多重功能：强CAT-like和POD-like酶活性、O₂•⁻和¹O₂自由基生成能力、GSH消耗能力、光热转化能力以及纳米马达自推进能力。在T98G胶质母细胞瘤细胞的体外实验中，PTT&CDT联合治疗实现了超过90%的细胞死亡，凋亡率达63.32%，DNA断裂显著，细胞迁移和增殖被有效抑制。本研究的科学价值在于：（1）证明Hb可作为有效的稳定剂和有机骨架，在一步水热条件下直接与Ru前驱体组装形成超小纳米酶；（2）揭示了Ru组分在酶活性和GSH消耗中的核心作用；（3）阐明了纳米马达运动增强细胞互作的机制；（4）验证了PTT升温对CDT酶活性的增强效应。在应用价值方面，该方法原则上可扩展至含Ag、Pt、Au、Pd、Rh和Ir等其他贵金属的Hb基纳米酶合成，为抗肿瘤和抗菌治疗剂的开发提供了一条通用而简便的合成路线，体外数据也为后续体内研究的系统设计奠定了基础。
本研究的突出创新点包括：（1）首次采用单阶段水热法直接合成Hb-Ru有机金属杂化纳米酶，避免了传统多步骤、模板辅助的复杂合成流程；（2）所得纳米颗粒粒径超小（约10 nm）且胶体稳定性优异，在水性介质中不易团聚；（3）Hb@Ru NPs具有独特的自推进纳米马达行为，可利用肿瘤微环境中的H₂O₂驱动运动，增强与肿瘤细胞的接触和摄取；（4）光热转化效率高达46.7%，带隙能量与808 nm NIR激光光子能量匹配，为高效的PTT提供了物理基础；（5）PTT与CDT的协同机制得到了多层面验证——温度升高直接增强酶活性和ROS产率，GSH消耗削弱肿瘤细胞的抗氧化防御，纳米马达运动促进细胞摄取，三者共同促成了92.7%的细胞杀伤效率。