一项关于肿瘤免疫治疗耐药新机制的研究报告
一、 主要作者与发表信息
本研究由来自美国密歇根大学医学院（University of Michigan School of Medicine）多部门的研究团队合作完成。主要作者为 Heng Lin 和 Ilona Kryczek 等人，通讯作者为 Weiping Zou。该项原创性研究成果于2021年4月12日发表在顶尖学术期刊《Cancer Cell》（第39卷，480-493页）上，论文标题为“Stanniocalcin 1 is a phagocytosis checkpoint driving tumor immune resistance”。
二、 学术背景
本研究的科学领域属于肿瘤免疫学，特别是针对肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中肿瘤细胞与免疫细胞相互作用，以及免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade, ICB）治疗耐药的机制探索。尽管以PD-1/PD-L1、CTLA-4抑制剂为代表的免疫疗法在一些癌症患者中取得了持久性缓解，但绝大多数患者对现有疗法无反应或产生耐药。既往研究揭示了多种耐药机制，包括肿瘤细胞基因突变、IFN-γ和MHC信号通路缺陷、T细胞功能耗竭以及代谢异常等。然而，关于抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APCs），特别是其吞噬功能（phagocytosis）在免疫治疗抵抗中的作用，尚不清楚。
研究团队从临床问题出发，旨在阐明肿瘤细胞内在的免疫抵抗新机制。他们通过分析已发表的、接受PD-1或CTLA-4抑制剂治疗的黑色素瘤患者转录组数据，寻找与治疗反应性相关的未知基因，进而探究这些基因如何调控肿瘤免疫及影响免疫治疗效果。其中，斯钙素1（Stanniocalcin 1, STC1）作为一个激素样蛋白被筛选出来，但其在肿瘤免疫中的作用完全未知。因此，本研究的目标是：1）验证STC1与免疫治疗疗效及患者生存的相关性；2）阐明肿瘤细胞STC1影响抗肿瘤免疫的具体机制；3）评估STC1作为潜在免疫治疗新靶点的价值。
三、 详细研究流程
本研究设计严谨，从临床数据挖掘到动物模型验证，再到分子机制解析，环环相扣。主要流程可分为以下五个核心环节：
1. 临床数据挖掘与STC1的发现（Figure 1）： - 研究对象： 两个独立的黑色素瘤患者队列（队列1：n=28，队列2：n=51），均接受抗PD-1治疗。 - 处理方法与实验： 比较治疗无应答者与应答者肿瘤组织的转录组数据，筛选在无应答者中共同高表达的基因。使用生物信息学分析确定候选基因。随后，在TCGA数据库中分析STC1表达与20种不同癌症类型患者总体生存率的关系。 - 数据分析流程： 设定阈值（差异倍数>2，p值<0.1）筛选差异表达基因，取交集。使用统计学方法比较STC1在应答者与非应答者中的表达差异，并通过Cox比例风险模型分析生存相关性。
2. 肿瘤STC1功能的体内验证（Figure 2）： - 研究对象： 具有不同内在免疫原性的三种小鼠肿瘤细胞系：MC38（结肠癌，对ICB高敏）、B16-F10（黑色素瘤，中度敏感）、LLC（Lewis肺癌，对ICB耐药）。免疫健全C57BL/6J小鼠和免疫缺陷NSG小鼠。 - 处理方法与实验： 利用基因工程技术构建细胞模型： - 在低表达STC1的MC38细胞中过表达STC1。 - 在中高表达STC1的B16-F10和LLC细胞中敲除（KO）STC1。 - 在LLC细胞中使用shRNA敲低（KD）STC1。 将这些基因修饰和对照的肿瘤细胞分别接种到C57BL/6J和NSG小鼠皮下，观察肿瘤生长。对已形成LLC肿瘤（STC1野生型vs敲除型）的C57BL/6J小鼠给予抗PD-L1抗体治疗。 - 工作流程： 通过体内肿瘤生长曲线，评估STC1在有无完整免疫系统情况下对肿瘤进展的影响，以及STC1是否影响ICB的疗效。
3. 肿瘤STC1对抗肿瘤T细胞反应的影响评估（Figure 3）： - 研究对象： 上述肿瘤模型小鼠的肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和肿瘤组织。 - 处理方法与实验： 使用多色流式细胞术（FACS）分析肿瘤浸润CD8+ T细胞的状态。 - 增殖能力： 检测Ki67+ CD8+ T细胞的比例。 - 功能活化： 检测IFN-γ+、TNF-α+、颗粒酶B+（granzyme B+）的CD8+ T细胞比例。 - 体内外联合验证： 使用表达卵清蛋白（OVA）的肿瘤细胞系，通过ELISpot或体外共培养实验，检测抗原特异性CD8+ T细胞（来自OT-I转基因小鼠）的活化情况。同时，在体外将重组STC1蛋白或不同STC1表达水平肿瘤细胞的培养上清液加入T细胞活化体系，观察其对T细胞功能的直接影响。
4. STC1通过靶向APCs削弱肿瘤免疫原性的机制探究（Figures 4 & 5）： - 研究对象： 体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和树突状细胞（BMDCs），以及OT-I CD8+ T细胞。 - 实验流程与方法： - APC功能实验（Figure 4）： 将BMDMs或BMDCs与经过UV照射致死的、负载OVA抗原的STC1过表达或敲除的肿瘤细胞共培养，再加入CFSE标记的OT-I T细胞。通过CFSE稀释检测T细胞增殖，并通过流式检测T细胞产生IFN-γ和颗粒酶B的水平。 - 吞噬功能实验（Figure 5a-c）： 使用荧光标记的死亡肿瘤细胞与巨噬细胞共孵育，动态监测巨噬细胞内荧光强度，评估吞噬效率。或共孵育后，加入pHrodo标记的微球，利用其进入酸性吞噬体后荧光增强的特性，通过流式评估吞噬体成熟度。 - 抗原提呈检测（Figure 5d）： 使用针对OVA肽-MHC I类分子复合物的抗体，通过流式检测巨噬细胞表面的抗原提呈水平。 - STC1相互作用蛋白鉴定（Figure 5e-f）： 这是一个关键的创新实验步骤。研究团队在稳定表达Flag标签STC1的B16-F10细胞中，使用抗Flag抗体进行免疫共沉淀，然后对沉淀物进行质谱分析，寻找与STC1结合的蛋白。 - STC1与CRT相互作用的验证（Figure 5f-k）： 采用免疫共沉淀、Duolink邻位连接技术、免疫荧光共定位、细胞膜蛋白生物素标记分离及亚细胞组分分离（线粒体、内质网、溶酶体富集）等多种方法，证实STC1与钙网蛋白（calreticulin, CRT）的相互作用，并精确定位其在细胞内的共定位（主要在线粒体区室），以及STC1过表达对膜表面CRT水平的影响。 - 遗传学拯救实验（Figure 5l-m）： 在CRT基因敲除（Calr-/-）的背景下，重复APC功能实验，检验CRT是否介导了STC1的抑制作用。 - APC耗竭的体内实验（Figure 4p-t）： 使用Batf3-/-小鼠（缺乏CD8α+ DCs亚群）和抗CSF1R抗体处理（清除巨噬细胞），在特定APC缺失的小鼠模型中，重新评估STC1对肿瘤生长和T细胞功能的影响。
5. 转录组学分析（补充数据）： 对吞噬了STC1过表达或对照肿瘤细胞的巨噬细胞进行RNA测序（RNA-seq），分析STC1对巨噬细胞整体基因表达谱的影响。
四、 主要研究结果
1. STC1是免疫治疗抵抗的负相关生物标志物。 分析显示，STC1在免疫治疗无应答者中显著高表达，且高STC1水平与黑色素瘤患者接受抗PD-1或抗CTLA-4治疗后的较短总生存期相关。TCGA数据分析进一步证实，在多种癌症类型（如BLCA、STAD、HNSC、LUAD等）中，高STC1表达普遍与不良预后相关。这与小鼠模型（MC38、B16-F10、LLC）中STC1表达水平与内在ICB敏感性呈负相关的现象一致。
2. 肿瘤内在的STC1是免疫抵抗的关键驱动因子。 体内实验表明，过表达STC1能促进MC38肿瘤在免疫健全小鼠中的生长，但不影响其在免疫缺陷小鼠中的生长；反之，敲除STC1能抑制B16-F10和LLC肿瘤在免疫健全小鼠中的生长，而在免疫缺陷小鼠中无此效应。这明确提示STC1通过调控宿主的免疫系统来促进肿瘤进展。更重要的是，原本对PD-L1抗体耐药的LLC肿瘤，在敲除STC1后变得敏感，显著响应治疗。这直接证明肿瘤STC1是ICB的内在耐药机制。
3. STC1损害抗肿瘤CD8+ T细胞反应，且不直接作用于T细胞，而是通过靶向APCs。 流式分析发现，携带STC1敲除肿瘤的小鼠，其肿瘤浸润CD8+ T细胞的增殖（Ki67+）和效应功能（IFN-γ+, Granzyme B+, TNF-α+）均显著增强。然而，体外实验表明，无论是重组STC1蛋白还是肿瘤细胞释放的STC1，均不能直接抑制T细胞的活化。关键在于，只有当死亡肿瘤细胞本身高表达STC1时，才会抑制APC（巨噬细胞或DC）对OVA特异性OT-I T细胞的激活能力。这提示STC1的作用靶点在于APCs。
4. STC1通过抑制APC的吞噬功能和抗原提呈能力来削弱肿瘤免疫原性。 吞噬实验直接证实，与死亡对照组肿瘤细胞相比，巨噬细胞对死亡STC1过表达肿瘤细胞的吞噬效率降低，吞噬体成熟减弱，其表面提呈的抗原肽-MHC I类复合物也减少。相应的，这些巨噬细胞激活T细胞的能力也下降。体内耗竭实验进一步证明，同时清除DCs和巨噬细胞，可以完全消除STC1对肿瘤生长的促进作用和对T细胞功能的抑制，说明STC1的作用依赖于这两类APCs。
5. 分子机制揭示：STC1作为细胞内“吃我”信号阻断剂，通过诱捕CRT发挥作用。 这是本研究的核心发现。质谱分析将CRT鉴定为STC1的关键相互作用蛋白。后续一系列生化与细胞生物学实验证实： - STC1与CRT直接结合，并且两者共同定位于细胞内的线粒体区域。 - STC1过表达不会改变CRT的总蛋白水平，但会将其“诱捕”在线粒体中，从而显著减少CRT在肿瘤细胞膜表面的暴露。 - CRT是已知的关键“吃我”（eat-me）信号，其膜暴露对于APC识别并吞噬死亡肿瘤细胞至关重要。 - 遗传拯救实验至关重要： 在CRT基因敲除的肿瘤细胞中，STC1过表达不再能抑制巨噬细胞的吞噬功能以及后续的T细胞激活。这明确证明，STC1对APC功能的抑制作用完全依赖于其对CRT的调控。 - RNA-seq数据显示，吞噬了STC1高表达肿瘤的巨噬细胞，其与细胞骨架重塑、离子通道、APC共刺激和成熟相关的基因表达下调，这为STC1的长效抑制作用提供了潜在解释。
逻辑关系总结： 临床数据发现STC1与不良预后相关 → 动物模型证明STC1是免疫抵抗的驱动因素 → 功能实验显示STC1损害T细胞反应但不直接作用于T细胞 → 机制聚焦于APCs → 发现STC1抑制APC吞噬和抗原提呈 → 分子筛选找到关键伙伴CRT → 验证STC1诱捕CRT于线粒体，减少膜CRT → 遗传学证明CRT是STC1功能的必要条件。整个研究链条逻辑严密，逐层深入。
五、 结论与意义
本研究得出了明确的结论：肿瘤来源的STC1通过与其相互作用蛋白CRT结合，将CRT“困”在线粒体中，从而减少肿瘤细胞膜表面的CRT暴露。膜CRT的减少削弱了APCs（巨噬细胞和DCs）对死亡肿瘤细胞的吞噬能力，进而损害了抗原提呈和CD8+ T细胞的活化，最终导致肿瘤免疫逃逸和对免疫检查点抑制剂的抵抗。因此，STC1作为一种前所未有的细胞内“吃我”信号阻断剂，可以被视为一个新的“吞噬检查点”。
本研究的科学价值在于：1）揭示了肿瘤免疫抵抗的全新机制，将研究焦点从T细胞和已知检查点，扩展到了APC吞噬功能这一上游关键环节。2）定义了STC1作为“吞噬检查点”的新功能，为理解肿瘤微环境中复杂的细胞交互提供了新视角。3）阐明了STC1-CRT相互作用的精确分子机制，即通过空间隔离（线粒体诱捕）来调控关键免疫信号分子的膜定位。
其应用价值更为显著：1）提供了新的预后生物标志物，STC1水平可用于预测患者对免疫治疗的响应和预后。2）指明了全新的治疗靶点，靶向STC1本身或破坏STC1与CRT的相互作用，有望成为一种新型的免疫治疗策略，用于逆转或预防免疫治疗耐药，使更多患者受益。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还通过RNA-seq初步探索了STC1对巨噬细胞转录组的长期影响，发现其可能下调了与吞噬作用执行、抗原处理提呈相关通路的一系列基因，这为进一步理解STC1如何持久性地“重编程”APC功能提供了线索，也是未来深入研究的方向。此外，研究团队在讨论部分将STC1与CD47-SIRPα、CD24-Siglec-10等已知的吞噬检查点通路进行了类比和定位，强调了其在癌症免疫治疗靶点谱系中的重要地位。