近日，Cell Metabolism（细胞代谢）期刊在线发表了一项由中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所李可研究员和栗琢绒副研究员团队领衔，与同济大学、中国医科大学第一附属医院等单位合作完成的重要研究成果，论文题为“Adipocyte-derived glutathione promotes obesity-related breast cancer by regulating the SCARB2-ARF1-mTORC1 complex”。该研究深入揭示了肥胖促进乳腺癌发生发展的新机制，为改善肥胖相关乳腺癌患者的预后提供了潜在的治疗靶点。以下是该项研究的详细学术报告。
一、 主要作者、研究机构及发表情况 本研究的第一作者是赵晨曦、张婷婷和薛斯图，通讯作者为中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所的李可研究员（like1986@163.com）和栗琢绒副研究员（lizhuorong@imb.pumc.edu.cn）。参与单位还包括同济大学医学院附属上海市第四人民医院、同济大学医学院癌症中心、同济大学医学院附属东方医院以及中国医科大学第一附属医院等。该研究于2024年9月24日被接受，最终在线发表于2025年3月4日的Cell Metabolism期刊第37卷第692-707页。
二、 研究学术背景 肥胖是多种癌症的重要风险因素，在女性中，乳腺癌是肥胖相关癌症死亡的主要原因之一。无论激素受体状态或绝经状态如何，高体重指数（BMI）的肥胖女性面临更高的乳腺癌发病率和死亡风险。尽管已知肥胖会诱导系统性代谢改变和以脂肪组织为主的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）局部改变，从而促进癌症进展，但连接肥胖与乳腺癌不良预后的精确分子机制尚不完全清楚。
肿瘤细胞的行为不仅受细胞内在因素调控，也受TME中代谢物可用性的影响。谷胱甘肽（Glutathione, GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，是细胞中最丰富的代谢物之一。细胞内和TME中GSH浓度升高与肿瘤发生、发展及耐药性相关。值得注意的是，GSH不仅参与抗氧化防御系统，还根据其细胞器特异性功能参与多种代谢过程。有研究发现，高GSH水平的患者体重更重，但GSH、肥胖与癌症进展之间的联系尚未明确。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target Of Rapamycin, mTOR）是最为人熟知的代谢物感应与信号通路。氨基酸通过两种不同途径激活mTORC1复合体：一种是Rag GTPases途径，另一种是通过V-ATPase介导的、由ADP-核糖基化因子1（ADP-ribosylation Factor 1, ARF1）参与的mTORC1溶酶体易位途径。尽管之前有研究表明GSH通过缓冲活性氧（ROS）来支持T细胞中的mTOR活性，但GSH是否直接激活mTOR，以及其在肥胖促进的乳腺癌中的作用及其与mTOR信号通路的潜在相互作用，仍需进一步研究。
基于此，本研究旨在探究肥胖乳腺癌TME中关键代谢物的变化，明确脂肪细胞来源的GSH在肥胖相关乳腺癌进展中的作用及其分子机制，特别是其与溶酶体mTORC1信号激活之间的关系。
三、 详细研究流程 本研究是一项系统性的实验科学探索，整合了体内外模型、多组学分析、分子生化实验和临床样本验证。其主要流程可分为以下几个部分：
流程一：建立肥胖加速乳腺癌模型并筛选关键TME代谢物。 * 研究对象与样本量：使用Balb/c小鼠构建饮食诱导肥胖（DIO）模型。小鼠分为正常饲料（NCD）组和高脂饲料（HFD）组（每组n=8），喂养9周后，于乳腺脂肪垫原位注射小鼠乳腺癌4T1细胞。此外，还使用了自发成瘤的MMTV-PyMT转基因小鼠模型（每组n=8），同样进行NCD或HFD喂养。 * 实验方法： 1. 表型分析：监测小鼠体重、肿瘤体积和重量，通过H&E染色统计肺转移结节数量，评估HFD对乳腺癌生长和转移的促进作用。 2. 代谢组学分析：收集HFD和NCD喂养小鼠的肿瘤间质液（Tumor Interstitial Fluid, TIF），进行非靶向代谢组学分析，筛选差异代谢物。 3. 功能筛选：选取代谢组学中差异最显著的前十种代谢物，在4T1等乳腺癌细胞系中进行体外增殖和侵袭实验，筛选出对癌细胞行为影响最显著的代谢物——谷胱甘肽（GSH）。 * 数据分析流程：通过统计比较HFD与NCD组间的表型差异，确定肥胖加速乳腺癌的表型。通过代谢组学数据的火山图分析和排名，结合体外功能实验验证，锁定GSH为候选关键代谢物。
流程二：探究GSH来源及其在肥胖促进乳腺癌中的作用。 * 研究对象： 1. 体内药理学干预：对HFD喂养的4T1荷瘤小鼠，使用GSH合成限速酶GCLC的抑制剂BSO处理。 2. 肿瘤细胞GSH敲除：利用CRISPR-Cas9技术敲除4T1细胞内的GCLC基因，并将其移植到HFD喂养的小鼠体内。 3. 脂肪细胞特异性GSH敲除：构建脂肪细胞特异性敲除GCLC的小鼠模型（Adipoq-Cre; Gclc fl/fl），并移植乳腺癌细胞。 4. 临床样本：收集肥胖与非肥胖乳腺癌患者的组织样本。 * 实验方法： 1. 多色免疫组化（mIHC）：对小鼠和人的乳腺癌组织进行多重荧光染色，标记脂肪细胞（Perilipin-1）、肿瘤细胞（CK19/K8）、内皮细胞（CD31）、成纤维细胞（α-SMA）、免疫细胞（CD45）以及GSH和GCLC，分析GSH在TME不同细胞类型中的分布和表达水平。 2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：定量检测不同来源细胞、TIF和血液中的GSH含量。 3. 共培养实验：将GSH合成缺陷（Gclc敲除）的脂肪前体细胞3T3-L1分化为脂肪细胞后，与乳腺癌细胞共培养，检测癌细胞的侵袭和增殖能力，并外源性添加GSN进行回补实验。 4. 细胞摄取与定位：使用荧光标记的GSH（GSH-FAM），通过流式细胞术和免疫荧光共定位技术，追踪外源性GSH被肿瘤细胞摄取后的亚细胞定位（溶酶体、线粒体、核糖体、内质网、高尔基体）。 * 数据分析流程：比较不同干预组（BSO处理、肿瘤细胞GCLC敲除、脂肪细胞GCLC敲除）的肿瘤生长和转移表型，结合mIHC和ELISA对GSH来源的定位和定量分析，明确脂肪细胞是肥胖TME中GSH的主要贡献者，且外源性GSH主要定位于肿瘤细胞的溶酶体。
流程三：揭示GSH通过溶酶体蛋白SCARB2发挥作用的机制。 * 研究对象：4T1、EMT6等乳腺癌细胞系，以及过表达相关质粒的HEK-293T细胞。 * 实验方法： 1. 蛋白质组学筛选：利用生物素标记的GSH进行Pull-down实验，结合质谱（MS）分析，鉴定潜在的GSH结合蛋白。溶酶体富集蛋白的质谱分析显示，溶酶体整合膜蛋白2（LIMP-2/SCARB2）是丰度最高的候选蛋白之一。 2. 相互作用验证：通过免疫共沉淀（Co-IP）、表面等离子共振（SPR）和免疫荧光共定位，证实GSH与SCARB2的直接结合及快速互作。 3. 功能丧失实验：利用CRISPR-Cas9敲除乳腺癌细胞中的SCARB2基因，在体外检测其对GSH促增殖和侵袭能力的影响，在体内将SCARB2敲除的肿瘤细胞移植到HFD或GSH处理的小鼠中，评估肿瘤进展。 4. 结构域与关键位点分析：通过构建SCARB2不同截短体和点突变体（如A444D），利用Co-IP、圆二色谱（CD）、AlphaFold结构预测和分子对接（AutoDock Vina）等技术，确定GSH与SCARB2 C末端结构域的结合，并找到关键结合残基A444。该位点突变会破坏GSH结合，并消除GSH的促癌功能。 5. 构象变化分析：通过Co-IP和邻位连接技术（PLA）发现，SCARB2的N端和C端在细胞内存在相互作用，而GSH的加入会削弱这种N-C端互作，诱导SCARB2发生构象变化。
流程四：阐明GSH-SCARB2轴激活mTORC1信号的具体通路。 * 研究对象：野生型及SCARB2、ARF1、mTOR、Rag GTPases等基因敲除/敲低的乳腺癌细胞。 * 实验方法： 1. 转录组与信号通路分析：对SCARB2野生型和敲除的4T1细胞进行RNA测序（RNA-seq）及基因集富集分析（GSEA），发现GSH能增强mTORC1下游信号通路，且该效应依赖于SCARB2。 2. mTORC1活性检测：通过Western Blot检测mTORC1底物p-S6K1和p-4E-BP1的磷酸化水平，评估mTORC1活性。通过免疫荧光观察mTOR与溶酶体标记物LAMP2的共定位，评估其溶酶体招募。 3. 通路依赖性验证： * ROS途径：使用抗氧化剂NAC清除ROS后，GSH仍能激活mTOR并促进癌细胞增殖侵袭，表明其作用不依赖于经典的ROS缓冲功能。 * Rag GTPases途径：敲除RagA/B后，GSH仍能激活mTOR，而氨基酸（缬氨酸）的激活作用被阻断，说明GSH通过Rag非依赖途径激活mTOR。 * ARF1途径：发现GSH能增强SCARB2与ARF1的相互作用。使用ARF1抑制剂布雷菲德菌素A（BFA）或敲除ARF1，能阻断GSH诱导的mTOR激活、溶酶体定位及促癌功能。回补实验显示，组成型激活的ARF1（ARF1-GTP）能恢复mTOR活性。 4. 复合体组装机制：通过GST Pull-down和Co-IP实验，发现GSH通过SCARB2促进ARF1与mTORC1复合体的亚基MLST8（而非mTOR或Raptor）之间的相互作用。敲低MLST8能消除GSH的促癌作用。 5. 体内验证：将ARF1或mTOR敲除的乳腺癌细胞移植到HFD喂养或GSH处理的小鼠体内，评估肿瘤生长和转移。
流程五：临床相关性分析及联合治疗策略探索。 * 研究对象：不同BMI的乳腺癌患者组织样本，以及肥胖乳腺癌小鼠模型。 * 实验方法： 1. 临床样本验证：通过免疫荧光/免疫组化，分析患者肿瘤组织中GSH与SCARB2的共定位、ARF1/MTOR的溶酶体定位，以及GSH摄入转运蛋白（SLC22A6, SLC22A8, SLC13A3）的表达与BMI的相关性。利用公共数据库进行SCARB2表达与乳腺癌患者预后的生存分析。 2. 治疗策略探索：在肥胖乳腺癌小鼠模型中，评估他莫昔芬（Tamoxifen, TAM）的疗效。并进一步在脂肪细胞特异性GCLC敲除（Adipoq-Cre; Gclc fl/fl）的肥胖小鼠中，测试TAM联合抑制GSH产生的治疗效果。 * 数据分析流程：统计分析临床指标（如共定位系数、蛋白表达水平）与BMI分组间的差异，以及生存曲线的显著性。比较不同治疗组小鼠的肿瘤体积、重量和信号通路蛋白磷酸化水平。
四、 主要研究结果 1. 肥胖乳腺癌TME中GSH水平升高，且主要来源于脂肪细胞。 代谢组学分析显示，HFD喂养小鼠的TIF中GSH水平显著升高。功能筛选证实GSH能有效促进乳腺癌细胞侵袭和增殖。尽管抑制肿瘤细胞自身GSH合成（敲除GCLC）不影响HFD的促癌效果，但抑制整体GSH合成（BSO处理）或特异性敲除脂肪细胞的GCLC，则能显著减缓HFD诱导的肿瘤生长和转移。mIHC和ELISA结果一致显示，在肥胖小鼠和肥胖乳腺癌患者的肿瘤组织中，脂肪细胞内的GSH和GCLC表达水平最高。这些结果表明，脂肪细胞是肥胖TME中GSH的主要分泌源，外源性GSH驱动了肥胖相关的乳腺癌进展。
2. 外源性GSH被肿瘤细胞摄取后定位于溶酶体，并通过结合SCARB2发挥作用。 流式细胞术证实肿瘤细胞能快速摄取外源性GSH。免疫荧光共定位显示，GSH主要聚集于溶酶体，而非其他细胞器。质谱筛选和系列生化实验鉴定出溶酶体膜蛋白SCARB2是GSH的关键结合蛋白。敲除SCARB2能完全消除GSH对乳腺癌细胞增殖、侵袭的促进作用，并在体内抵抗HFD和GSH注射诱导的肿瘤加速。这确定了SCARB2是GSH在溶酶体上发挥促癌功能的必需“传感器”。
3. GSH结合SCARB2的A444位点，诱导其构象变化。 通过截短体突变和丙氨酸扫描，研究人员将GSH与SCARB2的结合位点精确定位于其C末端结构域的第444位丙氨酸（A444）。AlphaFold结构预测和分子对接提示该位点可能与GSH形成氢键。A444D点突变破坏了GSH的结合，并使其丧失促癌功能。进一步机制研究发现，SCARB2的N端和C端在基础状态下存在相互作用，而GSH的结合干扰了这种N-C端互作，导致SCARB2蛋白构象发生改变。这从结构层面解释了GSH如何“启动”SCARB2的信号转导功能。
4. GSH-SCARB2通过ARF1激活mTORC1信号通路，该过程独立于Rag GTPases和ROS。 RNA-seq和GSEA分析指明GSH激活了mTORC1下游信号。Western Blot和免疫荧光证实，GSH能以时间依赖的方式诱导mTOR磷酸化及其向溶酶体的招募，这些效应均依赖于SCARB2和ARF1，而非Rag GTPases。使用抗氧化剂NAC清除ROS后，GSH的促mTOR和促癌作用依然存在，排除了其通过传统抗氧化途径起效的可能性。机制上，GSH增强了SCARB2与ARF1的相互作用。ARF1进而与mTORC1的亚基MLST8结合，促进mTORC1在溶酶体上的定位与激活。敲除ARF1或MLST8均能阻断GSH的所有促癌效应。体内实验再次证实，敲除ARF1或mTOR能有效抑制HFD或GSH处理下的肿瘤生长和转移。
5. 靶向GSH/mTOR轴有望改善肥胖乳腺癌的治疗。 临床样本分析显示，在超重/肥胖的乳腺癌患者组织中，GSH与SCARB2的共定位、ARF1/MTOR的溶酶体共定位以及GSH转运蛋白的表达均显著上调。生存分析表明高表达SCARB2与乳腺癌患者（包括Luminal A型、HER2+型和三阴性乳腺癌）的不良预后相关。在动物模型中，标准药物他莫昔芬（TAM）对肥胖乳腺癌疗效有限，但若联合抑制脂肪细胞GSH生成（如使用脂肪细胞GCLC敲除小鼠），则能显著增强TAM的疗效，并更有效地抑制肿瘤内mTORC1信号通路。这提示针对“GSH-SCARB2-ARF1-mTOR”轴的干预，特别是与现有疗法联用，可能是治疗肥胖相关乳腺癌的有效新策略。
五、 研究结论与意义 本研究系统性地揭示了一条连接肥胖与乳腺癌进展的全新代谢信号轴：肥胖导致肿瘤微环境中的脂肪细胞合成并分泌大量谷胱甘肽（GSH）；外源性GSH被肿瘤细胞摄取后，定位至溶酶体，直接结合溶酶体膜蛋白SCARB2（结合关键位点为A444）；该结合引发SCARB2构象变化，增强其与ARF1的互作；ARF1进而招募mTORC1复合体至溶酶体表面（通过结合MLST8亚基），从而激活mTORC1信号通路，最终驱动乳腺癌的生长和转移。
科学价值：该研究首次阐明了GSH作为脂肪细胞与肿瘤细胞间通信信使的非抗氧化功能，发现并解析了SCARB2作为细胞外GSH受体的全新功能，以及GSH通过SCARB2-ARF1轴激活mTORC1的独特机制。这深化了对肥胖如何重塑TME代谢、进而促进癌症的认识，为代谢与癌症信号交叉领域提供了新的理论依据。
应用价值：该研究明确了“脂肪细胞GSH - SCARB2 - ARF1 - mTORC1”信号轴是肥胖相关乳腺癌的脆弱环节。SCARB2、ARF1等分子可作为潜在的预后生物标志物。靶向该轴（如抑制GSH合成、干扰GSH-SCARB2结合、抑制ARF1功能等），尤其是与内分泌治疗等现有手段联合，有望为肥胖乳腺癌患者（尤其是对他莫昔芬不敏感者）开发出更有效的精准治疗策略。
六、 研究亮点 1. 机制新颖性：首次发现脂肪细胞来源的GSH可作为肥胖促进乳腺癌的远程信号分子，并完整解析了从细胞外GSH到细胞内mTORC1激活的完整信号传导链条（GSH→SCARB2→ARF1→mTORC1）。 2. 分子发现：首次鉴定溶酶体蛋白SCARB2为细胞外GSH的膜受体，并阐明了其通过构象变化转导GSH信号的分子机制，拓展了SCARB2的生物学功能认知