本研究由北京大学药学院天然药物学系的Yaning Gao、Xiang Li、Shizhong Chen，纽约血液中心Lindsley F. Kimball研究所的Wanbo Tai、Ning Wang、Shibo Jiang、Asim K. Debnath、Lanying Du，以及复旦大学上海医学院基础医学院的Shibo Jiang共同完成。该研究成果于2019年11月2日發表在期刊《Viruses》上，题为“Identification of Novel Natural Products as Effective and Broad-Spectrum Anti-Zika Virus Inhibitors”。

一、研究背景与目的

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种通过蚊虫传播的黄病毒（flavivirus），与登革病毒（dengue virus, DENV）、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒等同属一个属。ZIKV于1947年首次从恒河猴体内分离，但此前并未引起广泛关注。直到近年来，ZIKV感染与先天性寨卡综合征（congenital Zika syndrome, CZS）之间的密切关联被确认，CZS可导致小头畸形、胎儿死亡、中枢神经系统异常及其他神经系统并发症，才引起全球高度关注。然而，目前尚无针对ZIKV感染及相关人类疾病的获批抗病毒治疗药物，因此迫切需要开发安全有效的治疗药物。ZIKV的基因组编码一个多聚蛋白，随后被切割形成三个结构蛋白（衣壳蛋白C、膜前体/膜蛋白prM/M和包膜蛋白E）和七个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。在ZIKV生命周期中，E蛋白在病毒进入靶细胞及病毒与细胞膜融合过程中发挥关键作用，因此成为重要的治疗靶点。此外，DENV的四种血清型（DENV-1至DENV-4）每年导致大量登革热病例，因此开发广谱抗病毒抑制剂对治疗ZIKV及其他黄病毒（尤其是DENV）感染具有重要意义。本研究旨在通过筛选天然产物库，发现具有抗ZIKV活性的新型天然产物，并进一步评估其广谱抗病毒活性、作用机制及联合用药潜力。

二、研究流程与实验方法

本研究从MicroSource Discovery Systems提供的天然产物库中筛选了720种天然产物，以ZIKV近期流行人类毒株PAN2016为模型，利用噬斑减少抑制试验（plaque reduction assay）检测各化合物在20 μM浓度下对ZIKV感染的抑制活性。初步筛选得到61个抑制率超过70%的候选化合物，其中38个因在Vero E6细胞中表现出明显细胞毒性（显微镜下细胞毒性等级≥++）被排除，剩余23个低细胞毒性化合物中，有16个可购买，最终订购并复测6个，确认4个化合物（棉酚gossypol、姜黄素curcumin、洋地黄皂苷digitonin和锥丝碱conessine）的半数抑制浓度（IC50）低于半数细胞毒性浓度（CC50），被确定为先导化合物。随后，研究团队从Sigma购买纯度≥95%的上述化合物，通过CCK8细胞增殖/毒性检测试剂盒测定其在Vero E6细胞中的CC50，并利用噬斑减少试验测定其对ZIKV PAN2016毒株的IC50和IC90。为评估广谱活性，研究者进一步测试这些化合物对另外9株ZIKV毒株的抑制活性，这些毒株分离自不同宿主（人类、蚊子和恒河猴）、不同年份（1947–2016）和不同国家（墨西哥、巴拿马、哥伦比亚、洪都拉斯、波多黎各、泰国、尼日利亚和乌干达）。在机制研究中，采用时间添加实验（time-of-addition experiment）分析各天然产物在ZIKV感染生命周期中的作用阶段，具体包括六种处理方式：（a）病毒预处理：ZIKV与天然产物在37 °C共孵育1小时后再感染细胞；（b）细胞预处理：细胞先与天然产物孵育1小时，再加入ZIKV；（c）4 °C共处理：ZIKV与细胞在4 °C下共存以允许病毒附着但阻止膜融合，同时加入天然产物；（d）37 °C共处理：ZIKV与细胞在37 °C下同时加入天然产物；（e）融合抑制：细胞先在4 °C下与ZIKV孵育使病毒附着，随后加入天然产物并在37 °C下孵育使膜融合发生；（f）进入后阶段抑制：细胞先与ZIKV在37 °C孵育使病毒进入，再加入天然产物。实验中还设置了已知抗ZIKV化合物作为对照：temoporfin（病毒灭活）、25-羟基胆固醇（膜融合抑制）、bortezomib（广谱抗ZIKV）和NITD008（复制抑制）。为鉴定天然产物在ZIKV蛋白上的结合区域，研究者采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测天然产物与ZIKV全长E蛋白或包膜蛋白结构域III（envelope protein domain III, EDIII）的结合能力，并通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）测定棉酚与ZIKV E蛋白的结合亲和力。此外，利用ELISA竞争试验检测棉酚是否能阻断ZIKV EDIII与EDIII特异性中和单克隆抗体（SMZAB5、ZKA64-LALA、ZV-67或Z004）的结合，以确定其结合位点。在联合用药研究中，将棉酚分别与姜黄素、洋地黄皂苷、锥丝碱或bortezomib联合使用，检测对ZIKV PAN2016、FLR和PRVABC59三个毒株的抑制活性，并计算联合指数（combination index, CI）以判断协同效应。最后，利用噬斑减少试验检测这些天然产物对DENV-1至DENV-4四种血清型人类毒株在LLC-MK2细胞中的抑制活性。

三、主要研究结果

初步筛选结果显示，720种天然产物中有61个在20 μM时对ZIKV PAN2016毒株感染的抑制率超过70%，但其中38个因高细胞毒性被排除。最终确认的四个化合物中，棉酚、姜黄素、洋地黄皂苷和锥丝碱对ZIKV PAN2016的IC50分别为3.48 μM、13.67 μM、4.31 μM和9.75 μM，CC50分别为14.17 μM、52.86 μM、56.29 μM和323.71 μM。值得注意的是，除姜黄素此前已被报道具有抗ZIKV活性外，棉酚、洋地黄皂苷和锥丝碱均为首次报道具有抗ZIKV活性。在广谱性测试中，棉酚对10株ZIKV毒株的IC50范围为0.21–4.31 μM，是四种天然产物中抗病毒活性最强的，且优于阳性对照bortezomib（IC50范围7.67–31.04 μM）。棉酚对FLR毒株的IC50最低（0.21 μM）。时间添加实验表明，棉酚直接中和ZIKV，其抗病毒作用靶点为病毒本身而非宿主细胞或细胞相关的进入/复制阶段；姜黄素主要在病毒附着阶段发挥作用；洋地黄皂苷通过结合细胞受体或抑制病毒进入（附着和膜融合）及进入后步骤发挥作用；锥丝碱则主要通过抑制病毒-细胞膜融合或进入后阶段发挥作用。ELISA和SPR结果显示，棉酚与ZIKV全长E蛋白和EDIII蛋白的结合EC50分别为7.12 μM和4.22 μM，SPR测得其与E蛋白的平衡解离常数KD为2.19 μM。竞争试验表明，棉酚可以剂量依赖方式阻断EDIII特异性单抗SMZAB5、ZKA64-LALA、ZV-67和Z004与EDIII的结合，IC50分别为7.32 μM、5.72 μM、11.7 μM和22.2 μM，但对照单抗ZKA78不与EDIII结合，因此无抑制现象。由于这些单抗识别EDIII的侧脊（lateral ridge）区域（包括残基309–314、331–337、368、370、371和393–397），提示棉酚可能结合于ZIKV EDIII的侧脊区域。联合用药实验中，棉酚与姜黄素、洋地黄皂苷或锥丝碱联用对ZIKV PAN2016、FLR和PRVABC59毒株均表现出显著协同抑制作用，CI值分别介于0.44–0.60、0.44–0.95和0.19–0.30之间，均小于1，表明协同效应。其中对PRVABC59毒株的协同效应最强，棉酚与bortezomib联用时CI值低至0.19，体现非常强的协同作用。细胞毒性检测显示，联用并未显著增加Vero E6细胞的毒性（CI值均大于1），表明IC50的降低并非由细胞毒性增强所致。在抗DENV活性测试中，四种天然产物均能抑制DENV-1至DENV-4感染，其中棉酚对DENV-1、DENV-2和DENV-4的IC50最低（分别为1.87 μM、1.89 μM和2.60 μM），对DENV-3的IC50为3.70 μM，略高于姜黄素的2.09 μM，但整体上棉酚仍表现出最强的广谱抗登革病毒活性。

四、研究结论与意义

本研究通过筛选天然产物库，鉴定出四种具有抗ZIKV活性的天然产物——棉酚、姜黄素、洋地黄皂苷和锥丝碱，其中后三种为首次报道具有抗ZIKV活性。棉酚的抗病毒活性最强，对10株不同来源和年份的ZIKV毒株均表现出广谱抑制作用，且对DENV四种血清型同样具有强效抑制活性。机制研究表明，棉酚通过直接结合ZIKV E蛋白的EDIII区域，阻断病毒与细胞受体的相互作用，从而中和病毒感染。相比之下，姜黄素主要抑制病毒附着，洋地黄皂苷和锥丝碱则作用于宿主细胞或病毒进入/进入后阶段。此外，棉酚与姜黄素、洋地黄皂苷、锥丝碱或bortezomib联用均表现出显著的协同抗ZIKV效应，提示联合用药策略具有潜在临床应用价值。尽管棉酚本身具有一定的毒性和副作用，作者建议将其作为先导分子进行结构修饰，而非直接作为药物使用，其对称分子结构为碎片化改造为更小、活性更高、毒性更低的药物样分子提供了机会。本研究的科学价值在于首次系统鉴定了多种天然产物对ZIKV和DENV的广谱抑制活性，并阐明了其作用机制，为开发新型广谱抗黄病毒抑制剂提供了重要的理论基础和候选化合物。应用价值在于这些天然产物或其衍生物有望进一步开发为治疗ZIKV和DENV感染的抗病毒药物，尤其是针对先天性寨卡综合征和其他黄病毒相关疾病的防治。

五、研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，首次报道棉酚、洋地黄皂苷和锥丝碱具有抗ZIKV活性，其中棉酚表现出对10株ZIKV毒株和4种DENV血清型的广谱强效抑制作用。第二，通过时间添加实验和ELISA/SPR技术明确了棉酚的作用靶点为ZIKV E蛋白EDIII的侧脊区域，为理解其广谱抗黄病毒机制提供了分子基础。第三，系统评估了棉酚与其他天然产物或已知抗病毒化合物的联合用药效果，发现多种组合均具有协同作用，且联合用药未显著增加细胞毒性，为未来联合治疗策略提供了实验依据。第四，本研究采用多种手段（噬斑减少试验、时间添加实验、ELISA、SPR、细胞毒性检测等）从活性筛选到机制解析形成了完整的药物发现流程，具有较强的可重复性和参考价值。