本研究发表于2021年的学术期刊《pharmacological research》第169卷，由通讯作者Ming Zhao和Jinao Duan领导的研究团队完成。第一作者包括Pengfei Zhang、Weiwei Tao和Cai Lu。主要研究机构包括中国南京中医药大学、美国伊利诺伊大学芝加哥分校药学院等。
研究的学术背景聚焦于胰腺癌的治疗困境和代谢靶向治疗新策略。胰腺癌是极具侵袭性的恶性肿瘤之一，预后极差，五年生存率低。目前，手术是唯一可能的根治手段，但由于早期诊断困难，仅不到20%的患者有手术机会。药物治疗，特别是吉西他滨，是主要手段，但存在疗效有限和耐药问题。因此，发现新的生物靶点和药物迫在眉睫。癌症细胞，包括胰腺癌细胞，即使在有氧条件下也倾向于将大量葡萄糖转化为乳酸，这一特征被称为“瓦博格效应”（Warburg effect）或有氧糖酵解。这种代谢重编程为癌细胞快速生长提供能量和前体物质，并帮助其抵抗凋亡信号，因此糖酵解通路成为癌症治疗的重要潜在靶点。磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶4（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 4, PFKFB4）是糖酵解的关键调控双功能酶，能合成果糖-2,6-二磷酸以刺激糖酵解。此前研究表明PFKFB4在多种人类癌细胞中过表达，但其在胰腺癌有氧条件下的作用尚未明确。同时，糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK3β）作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，不仅参与糖原合成和能量稳态，也在细胞凋亡、衰老、增殖和分化中起关键作用，暗示其可能与PFKFB4存在功能联系。本研究的对象是鸦胆子苦素A（Bruceine A），一种从传统用于治疗癌症的中药鸦胆子（Brucea javanica）中提取的苦木素类化合物。团队前期研究发现鸦胆子果实具有显著的体外和体内抗胰腺癌活性，但鸦胆子苦素A是否通过抑制糖酵发挥抗癌作用及其具体机制尚不清晰。因此，本研究旨在探究鸦胆子苦素A的抗胰腺癌活性，并阐明其是否通过靶向PFKFB4/GSK3β信号通路抑制糖酵解来实现。
研究的详细工作流程包含多个严谨的实验环节。首先，研究评估了鸦胆子苦素A对多种胰腺癌细胞系增殖的抑制效果。通过MTT法检测了不同浓度鸦胆子苦素A处理24、48、72小时后，对人胰腺癌细胞系（Mia PaCa-2, SW1990, Panc-1, AsPC-1）以及作为对照的其他肿瘤细胞（MCF7, A549, HepaRG）和正常人胰腺上皮细胞（HPDE6-C7）活力的影响。流式细胞术被用于分析细胞周期分布和凋亡情况（Annexin V/PI双染）。Western blot检测了细胞周期相关蛋白（CDK4, CDK6, Cyclin D1）和凋亡相关蛋白（cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, cleaved PARP）的表达变化。
其次，为鉴定鸦胆子苦素A的直接作用靶点，研究团队合成了生物素标记的鸦胆子苦素A探针（biotin-bruceine A），并利用包含20,000个人类蛋白质的重组蛋白微阵列（HuProt 20K human proteome microarray）进行高通量筛选。将探针与蛋白芯片孵育后，使用Cy5标记的链霉亲和素检测结合信号。通过Z-score和信号强度比值等生物信息学分析，从阳性结合蛋白中筛选候选靶点。接着，对筛选出的候选蛋白进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以明确其主要的生物学功能和通路。进一步，利用STRING数据库构建蛋白相互作用网络，并通过Cytoscape软件的MCODE插件分析高度互连的蛋白簇。
第三，针对候选靶点PFKFB4，研究通过多种生物物理和计算化学方法验证其与鸦胆子苦素A的直接相互作用。使用荧光光谱法检测鸦胆子苦素A对PFKFB4蛋白内源性荧光的淬灭效应。采用微量热泳动技术（Microscale Thermophoresis, MST）精确测定两者结合的平衡解离常数（Kd）。此外，运用Discovery Studio 3.0软件进行分子对接模拟，预测鸦胆子苦素A与PFKFB4蛋白的可能结合位点和相互作用模式。
第四，深入探究鸦胆子苦素A通过PFKFB4介导的糖酵解抑制发挥作用的机制。检测了鸦胆子苦素A处理后Mia PaCa-2细胞内葡萄糖消耗和乳酸产量的变化。通过Western blot和免疫荧光检测了糖酵解关键蛋白（GLUT1, HK2, PFKFB4, PFKM, PKM2, LDHA）的表达水平。使用实时定量PCR检测了PFKFB4及其同工酶PFKFB2、PFKFB3的mRNA水平。为明确PFKFB4的功能，在Mia PaCa-2细胞中分别转染PFKFB4过表达质粒和特异性小干扰RNA（siRNA），通过MTT、葡萄糖/乳酸检测、Western blot等手段，评估PFKFB4对细胞增殖、糖酵解及鸦胆子苦素A效应的影响。
第五，探索PFKFB4的下游信号。通过在线数据库（GEPIA）分析GSK3β在胰腺癌组织与正常组织中的mRNA表达差异及其与患者预后的相关性。在Mia PaCa-2细胞中，通过免疫共沉淀验证PFKFB4与GSK3β的蛋白相互作用。检测鸦胆子苦素A处理后GSK3β蛋白水平的变化。通过过表达PFKFB4或GSK3β，研究两者在调控糖酵解和介导鸦胆子苦素A效应中的上下游关系。同样，使用过表达模型，评估GSK3β在逆转鸦胆子苦素A引起的增殖抑制、周期阻滞和凋亡中的作用。
第六，进行体内实验验证。建立BALB/c裸鼠Mia PaCa-2细胞皮下移植瘤模型。将荷瘤鼠随机分为对照组、吉西他滨阳性药组以及不同剂量的鸦胆子苦素A治疗组（0.02, 0.1, 0.5 mg/kg），通过尾静脉注射给药10天。期间监测小鼠体重和肿瘤体积。给药结束后，处死小鼠，称量瘤重，采集肿瘤组织。通过Western blot检测肿瘤组织中PFKFB4和GSK3β的蛋白水平，通过免疫组织化学染色检测肿瘤细胞增殖标志物PCNA和Ki67的表达。
数据统计分析方面，体外实验数据以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析及事后检验，涉及两个变量的采用双因素方差分析及事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。所有分析均使用GraphPad Prism软件完成。
研究取得了一系列明确的结果。体外活性筛选显示，鸦胆子苦素A能以时间和剂量依赖性的方式显著抑制多种人胰腺癌细胞系的增殖，其中对Mia PaCa-2细胞最为敏感，且对正常人胰腺上皮细胞HPDE6-C7无明显毒性，显示出良好的选择性。机制上，鸦胆子苦素A能将Mia PaCa-2细胞阻滞在G1期，并下调CDK4、CDK6和Cyclin D1的蛋白表达。同时，它能剂量依赖性地诱导Mia PaCa-2细胞凋亡，并上调cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP的水平。
蛋白微阵列筛选共鉴定出232个鸦胆子苦素A的结合候选蛋白。GO和KEGG富集分析强烈提示这些蛋白显著富集于糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢等通路。蛋白互作网络分析进一步确认了糖酵解相关蛋白的高度互连，并将PFKFB4识别为网络中的关键节点。随后的验证实验证实，鸦胆子苦素A能直接与PFKFB4蛋白结合，MST测得的Kd值为44 nM。分子对接预测鸦胆子苦素A可能结合于PFKFB4的活性位点1。
功能实验表明，鸦胆子苦素A能剂量依赖性地降低Mia PaCa-2细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生，并抑制包括PFKFB4在内的多个糖酵解关键酶的蛋白表达。有趣的是，鸦胆子苦素A选择性地下调了PFKFB4的mRNA水平，却上调了其同工酶PFKFB2和PFKFB3的mRNA，提示其抑制作用可能具有特异性。遗传学实验证明，PFKFB4本身能促进Mia PaCa-2细胞的增殖和糖酵解；而过表达PFKFB4能显著逆转鸦胆子苦素A对细胞增殖的抑制、对细胞周期蛋白的下调以及对凋亡蛋白的上调作用，这表明PFKFB4介导的糖酵解抑制是鸦胆子苦素A发挥抗癌作用的关键机制之一。
数据库分析显示，GSK3β在胰腺癌组织中表达上调，且高表达与患者不良预后相关。在Mia PaCa-2细胞中，免疫共沉淀证实PFKFB4与GSK3β存在物理相互作用。鸦胆子苦素A能剂量依赖性地降低GSK3β的蛋白水平。上游调控实验发现，过表达PFKFB4可以逆转鸦胆子苦素A引起的GSK3β下调，而过表达GSK3β不影响PFKFB4水平，表明GSK3β是PFKFB4的下游靶点。功能挽救实验显示，过表达GSK3β能增强糖酵解，并能部分逆转鸦胆子苦素A诱导的增殖抑制、周期阻滞和凋亡。
体内实验结果表明，不同剂量的鸦胆子苦素A（0.02, 0.1, 0.5 mg/kg）治疗均能剂量依赖性地抑制裸鼠移植瘤的生长，且0.5 mg/kg剂量的抑瘤效果与阳性药吉西他滨相当。治疗期间小鼠体重和主要脏器指数未见明显异常，提示其体内毒性较低。肿瘤组织分析显示，鸦胆子苦素A治疗组中PFKFB4和GSK3β的蛋白表达下调，增殖标志物PCNA和Ki67的阳性细胞数也显著减少，与体外结果一致。
本研究的结论是：鸦胆子苦素A在体外和体内均表现出强效的抗胰腺癌活性。其作用机制是通过直接靶向并结合PFKFB4，抑制胰腺癌细胞的糖酵解代谢，从而导致细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡。研究首次发现并证实GSK3β是PFKFB4的下游信号分子和相互作用蛋白，并参与了鸦胆子苦素A诱导的生长抑制和凋亡过程。因此，鸦胆子苦素A通过抑制PFKFB4/GSK3β介导的糖酵解通路来抑制胰腺癌细胞生长。
本研究的科学价值与应用意义重大。在科学价值层面：1. 首次系统阐明了天然化合物鸦胆子苦素A抗胰腺癌的作用机制，将其抗癌活性与肿瘤代谢重编程（糖酵解）明确联系起来，为理解苦木素类化合物的药理作用提供了新视角。2. 首次报道PFKFB4是鸦胆子苦素A的直接作用靶点，并将鸦胆子苦素A定义为一个新型的PFKFB4抑制剂，为靶向肿瘤代谢的药物研发提供了新的先导化合物。3. 创新性地发现并验证了在胰腺癌中PFKFB4与GSK3β之间存在相互作用及上下游调控关系，拓展了人们对糖酵解酶与激酶信号网络交叉对话的认识，为胰腺癌的病理机制研究提供了新线索。4. 研究整合了蛋白组学筛选、生物物理验证、分子对接、遗传学操作和体内模型等多种技术手段，形成了一个完整、严谨的机制研究范式。在应用价值层面：1. 鸦胆子苦素A作为源自传统中药的天然产物，显示出良好的抗胰腺癌活性和选择性，毒性较低，具有开发成为新型抗胰腺癌药物的潜力，特别是为解决吉西他滨耐药问题提供了可能的选择。2. PFKFB4和GSK3β作为胰腺癌预后相关的潜在靶点，其组合（PFKFB4/GSK3β轴）可能成为未来胰腺癌诊断和治疗的生物标志物及药物靶标。
本研究的亮点包括：1. 重要的研究发现：明确揭示了鸦胆子苦素A抗胰腺癌的完整信号通路（PFKFB4/GSK3β介导的糖酵解抑制），并首次报道了PFKFB4与GSK3β在胰腺癌中的功能联系。2. 新颖的研究方法：创造性合成了生物素标记的鸦胆子苦素A探针，并利用大规模人类蛋白组芯片进行靶点筛选，结合MST等精准生物物理技术进行验证，为天然产物靶点鉴定提供了高效、可靠的研究策略。3. 研究对象的特殊性：聚焦于预后极差的胰腺癌，并选择具有中药研究背景、活性明确但机制不明的天然小分子鸦胆子苦素A作为研究对象，兼具传统医学经验和现代科学探索的价值。4. 机制研究的深度与系统性：从表型到靶点，从体外到体内，从上游靶点到下游信号，构建了完整的证据链，逻辑清晰，论证充分。
其他有价值的内容包括：研究团队在讨论中提出了一个有趣的推测，即鸦胆子苦素A抑制糖酵解可能导致细胞代谢从糖酵解转向线粒体氧化磷酸化，从而可能激活活性氧（ROS）产生，这或许可以解释团队前期关于同类化合物鸦胆子苦素D通过ROS-p38 MAPK通路发挥作用的发现，暗示了不同机制之间可能存在内在联系。此外，研究也提及了通过生物转化或化学合成提高鸦胆子苦素A产率的可能性，为其后续开发提供了思路。