学术研究报告：基于SDS-毛细管琼脂糖凝胶电泳的宽分子量范围治疗性蛋白质快速无基线干扰分析

第一作者及单位
本研究由匈牙利德布勒森大学医学院Horváth Csaba纪念生物分离科学实验室的Dániel Sárközy、Anna Farkas及通讯作者András Guttman（同时任职于匈牙利潘诺尼亚大学生物分子与化学工程研究所）合作完成，发表于2025年的Analytica Chimica Acta期刊（Volume 1360, 344147）。

学术背景

研究领域与动机
该研究属于生物制药分析化学领域，聚焦于治疗性蛋白质（如单克隆抗体、融合蛋白）的纯度与完整性检测。传统方法如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）存在分析时间长、基线干扰（如“基线驼峰”，baseline hump）等问题，影响定量准确性。尤其是高分子量（>200 kDa）和高度糖基化蛋白质的分析，因商业化的葡聚糖-硼酸盐凝胶基质易产生基线波动，成为行业十年未解的难题。

科学目标
本研究提出一种新型的四羟基硼酸盐交联琼脂糖凝胶基质（borate-stabilized agarose gel），旨在实现：
1. 快速（分钟）、高分辨率的治疗性蛋白质分离；
2. 消除基线干扰，提升高分子量蛋白质（如660 kDa甲状腺球蛋白）的定量可靠性；
3. 验证该方法在复杂生物药（如抗SARS-CoV-2抗体Bamlanivimab、融合蛋白Etanercept）中的适用性。

实验流程与创新方法

1. 凝胶基质制备
- 配方：640 mM硼酸（pH 8.0 Tris调节）、2 mM EDTA、10%甘油、0.8%低熔点琼脂糖，加热至沸腾后加入0.2% SDS。
- 创新点：与传统葡聚糖凝胶相比，琼脂糖的双螺旋结构通过硼酸根动态交联，形成更稳定的筛分网络，且粘度低（8.9 mPa·s vs. 葡聚糖凝胶的100 mPa·s），减少焦耳热效应。

2. 样本处理
- 研究对象：
- Bamlanivimab（抗SARS-CoV-2单抗，150 kDa）：还原与非还原条件下分析轻链（LC, 25 kDa）、重链（HC, 50 kDa）及完整抗体。
- Etanercept（融合蛋白，150 kDa，含3个N-糖基化和13个O-糖基化位点）：PNGase F酶切去除N-糖链后对比迁移行为。
- 甲状腺球蛋白（660 kDa）：验证高分子量蛋白质的分离能力。
- 样本前处理：80℃变性15分钟（甲状腺球蛋白为70℃ 20分钟），还原条件使用2-巯基乙醇，非还原条件使用碘乙酰胺。

3. 毛细管电泳条件
- 仪器：Beckman Coulter PA 800+系统，10 cm有效长度毛细管（50 μm内径），UV 214 nm检测。
- 参数：电场强度500 V/cm，阴极进样，5 kV进样20秒，25℃恒温。
- 数据软件：PeakFit 4.12进行峰拟合与积分。

4. 对比实验
- 使用商业葡聚糖凝胶（SDS-MW Gel Buffer）进行平行实验，验证基线稳定性与分辨率差异。

主要结果与逻辑链条

1. 基线稳定性突破
- 关键数据：琼脂糖凝胶在Bamlanivimab完整抗体峰（5.25分钟）后15分钟内无基线波动（图2），而葡聚糖凝胶出现显著驼峰（Supplementary Fig. 1）。
- 机制解释：琼脂糖的低电渗流（EOF, -5.71×10⁻⁹ m²/V·s）和低电流（36 μA）减少电化学干扰。

2. 快速高分辨率分离
- Bamlanivimab亚基分析：非糖基化重链（NGHC, 4.48分钟）与糖基化重链（HC, 4.68分钟）分辨率达1.65（图1插图），优于葡聚糖凝胶的1.32。
- 高分子量蛋白质：甲状腺球蛋白单体（330 kDa）和二聚体（660 kDa）在7.42分钟内完成分离（图3b），迁移时间对数与分子量线性相关。

3. 糖基化影响研究
- Etanercept：PNGase F处理后因O-糖链残留，迁移时间延长（6.34分钟 vs. 未处理样本），揭示糖基化对SDS-蛋白质复合物电荷/体积比的非线性影响（图3a）。

结论与价值

科学意义
1. 方法学创新：首次将硼酸盐交联琼脂糖凝胶应用于CE-SDS，解决了基线干扰这一行业痛点。
2. 应用扩展：支持从6 kDa至660 kDa的宽分子量范围分析，尤其适用于单抗、融合蛋白等复杂生物药。

工业价值
- 质量控制：为生物制药行业提供快速（5分钟）、高重现性（迁移时间RSD <0.3%，峰面积RSD %）的纯度检测方案。
- 法规兼容性：符合ICH Q6B对蛋白质药物纯度分析的要求，潜在替代传统SDS-PAGE。

研究亮点

1. 基线无干扰：首次实现高分子量蛋白质分离的稳定基线，突破传统葡聚糖凝胶的限制。
   
2. 超快分析：10 cm短毛细管结合高电场强度，将分析时间缩短至商业方法的1/5。
   
3. 多场景验证：涵盖抗体亚基、高度糖基化蛋白、超高分子量蛋白三类挑战性样本。
   

局限性
需使用低电渗流琼脂糖，且高温（>75℃）可能导致凝胶固化，需优化储存条件。

补充数据
原文附Supplementary Data（DOI: 10.1016/j.aca.2025.344147），包含葡聚糖凝胶基线干扰对比图及甲状腺球蛋白二聚体质谱验证数据。