学术研究报告：30色全光谱流式细胞术在鼠类肿瘤组织T细胞亚群深度免疫表型分析中的应用

一、研究团队与发表信息
本研究由Ying Liu、Xiye Xu、Di Liu等共同完成，通讯作者为Li Tang。研究团队来自中国北京蛋白质组研究中心的蛋白质组学国家重点实验室（State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center）及中国医学科学院精准医学研究单元（Research Unit of Proteomics Driven Cancer Precision Medicine）。研究成果发表于《Journal of Immunological Methods》2023年3月刊（Volume 516, 113459）。

二、学术背景与研究目标
T细胞是适应性免疫的核心，其浸润数量与状态直接影响肿瘤发展和治疗效果。然而，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中T细胞的异质性和功能状态复杂，传统流式细胞术因荧光通道限制难以全面解析。尽管质谱流式技术（Mass Cytometry）可检测高维度参数，但其成本高、耗时长且无法分选活细胞。因此，本研究旨在开发一种基于30色全光谱流式细胞术（Full Spectrum Flow Cytometry）的高通量检测方案，用于深度分析小鼠肿瘤浸润T细胞及脾脏T细胞的免疫表型，涵盖激活状态、共刺激/共抑制分子、细胞因子及细胞毒性分子等关键标志物。

三、研究流程与方法
1. 实验设计与试剂选择
- 仪器配置：采用Cytek® Aurora 5激光（355/405/488/561/640 nm）64检测器系统，优化30种荧光染料的组合，通过光谱分析工具（Cytek Spectrum Viewer）评估荧光兼容性。
- 标志物选择：包括T细胞亚群标志物（CD4、CD8、γδTCR等）、激活状态标志物（CD44、CD62L、Ki67等）、共抑制分子（PD-1、TIM-3、CTLA-4等）及功能分子（IFN-γ、穿孔素Perforin等）。

1. 样本处理与数据采集

   • 样本来源：B16-F10黑色素瘤模型小鼠的肿瘤组织和脾脏。
     
   • 细胞分离：肿瘤组织经IV型胶原酶消化后，通过红细胞裂解液处理；脾脏制备单细胞悬液，经抗CD3/CD28体外重刺激。
     
   • 染色方案：分单染（SS）和多色染色（MS），表面标志物染色后固定破膜检测胞内分子（如Ki67、细胞因子）。
     
   • 数据获取：使用Cytek Aurora系统采集数据，FlowJo 10.8.1和SpectroFlo 3.0.0进行降维分析（UMAP）和聚类（FlowSOM）。
     

2. 数据分析流程

   • 手动设门策略：排除死细胞和双联体后，依次鉴定CD11b+髓系细胞、B细胞、NKT细胞等，最终聚焦CD4+和CD8+ T细胞（图1a）。
     
   • 功能亚群解析：通过标志物组合划分效应T细胞（如CD44+CD62L-）、耗竭T细胞（PD-1+TIM-3+）等，并分析其细胞毒性分子表达（图1b-d）。
     
   • 无监督聚类：UMAP降维显示肿瘤浸润T细胞可进一步分为耗竭型、效应型等亚群（图1e-g），脾脏T细胞则呈现不同的激活模式（图2）。
     

四、主要研究结果
1. T细胞亚群特征
- 肿瘤浸润CD8+ T细胞中，CD44+CD62L-亚群高表达穿孔素和颗粒酶B，提示其细胞毒性功能（图1b）。
- 共抑制分子（如PD-1、TIGIT）的共表达标志T细胞耗竭状态，与肿瘤免疫逃逸相关（图1c）。

1. 功能验证

   • 未重刺激的肿瘤T细胞中细胞因子（如IFN-γ）表达较低，但通过标志物组合仍可识别功能亚群（图1d）。
     
   • 脾脏T细胞经体外刺激后表型显著变化，验证了实验设计的敏感性（图2）。
     

2. 技术优势

   • 全光谱流式细胞术通过解耦光谱重叠，实现30色高维检测，较传统流式提升3倍参数容量。
     

五、研究结论与价值
本研究建立的30色方案为TME中T细胞异质性研究提供了高分辨率工具，其科学价值包括：
1. 方法学创新：首次在小鼠模型中整合激活、耗竭、细胞毒性等多维度标志物，克服了传统技术的局限性。
2. 应用潜力：可拓展至其他免疫相关疾病模型（如自身免疫病），并为免疫治疗疗效评估提供新策略。
3. 局限性：未重刺激样本中细胞因子检测灵敏度不足，未来需优化实验条件。

六、研究亮点
1. 高维度检测：30色方案为目前小鼠T细胞表型分析的最高通量方法之一。
2. 临床相关性：揭示了PD-1+TIM-3+耗竭T细胞与肿瘤免疫治疗的潜在关联。
3. 开源参考：实验方案参考了OMIP系列（如OMIP-069），为同行提供标准化流程。

七、其他价值
研究得到国家自然科学基金（32200736）和中国医学科学院创新基金（2019-12M-5-063）支持，数据可通过补充材料获取（DOI: 10.1016/j.jim.2023.113459）。